Plackett-Burman試驗聯(lián)用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶培養(yǎng)基營養(yǎng)成分

李達，孫慕白，苗欣宇，牛紅紅，孫瑞悅，王景會*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長春 130033；2.延邊大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 延吉 133002)

淀粉酶是工業(yè)上重要的酶，約占世界酶市場的65%[1]。其中食品工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的α-淀粉酶主要用于水解淀粉制造葡萄糖[2]等糖類原料，以及生產(chǎn)糊精[3]、醋[4]、果汁[5]和味精等調(diào)味料，還用于面包等面制品生產(chǎn)品質(zhì)改良劑[6]、食品原料澄清工藝[7]等加工業(yè)，是一種潛在價值極高的食品用酶[8]?？莶菅挎邨U菌因其菌種可靠性、易于操作和生產(chǎn)成本低廉的大規(guī)模生產(chǎn)工藝等特點被用于淀粉酶的商業(yè)生產(chǎn)[9]。

微生物生產(chǎn)酶類的關(guān)鍵因素之一是獲得高產(chǎn)能(單位時間內(nèi)單位體積形成的酶類產(chǎn)品數(shù)量)。微生物高密度生產(chǎn)酶類培養(yǎng)技術(shù)主要核心在于提高生產(chǎn)率，該技術(shù)還有其他優(yōu)點，如減少培養(yǎng)體積，減少廢水，減少設(shè)備投資和加強下游處理。優(yōu)化發(fā)酵液的營養(yǎng)組成成分是獲得高密度生產(chǎn)酶類最常用的技術(shù)之一[10]。培養(yǎng)基中常見的必需營養(yǎng)素來源是碳、氫、氮、氧和磷。微生物通常以有機形式吸收碳。有機碳通常是生物的產(chǎn)物[11]。氮的另一種基本營養(yǎng)素是蛋白質(zhì)、DNA、RNA和ATP結(jié)構(gòu)的一部分。氮對異養(yǎng)生物的生存非常重要，但必須降解成氨基酸等基本成分才能使用[12]。無機鹽是細(xì)胞生命物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)移的重要參與者。沒有足夠的無機鹽，生物就會停止生長[13]。因此，適宜的營養(yǎng)環(huán)境是微生物高濃度生產(chǎn)酶類的必要條件，也是生產(chǎn)工藝調(diào)控的重要手段之一。

先前對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，包括碳源、氮源和無機鹽在內(nèi)的培養(yǎng)營養(yǎng)成分是影響細(xì)胞生酶的主要因素，而響應(yīng)面法(RSM)是優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶量的有效策略。與傳統(tǒng)的統(tǒng)計分析優(yōu)化方法相比，RSM是一種省時、省力的方法，主要有中心組合設(shè)計(CCD)、Box-Benhnken(BBD)、單因素設(shè)計、優(yōu)化設(shè)計、用戶定義設(shè)計和歷史數(shù)據(jù)設(shè)計。RSM已成功用于許多產(chǎn)品的生產(chǎn)優(yōu)化，包括酶、抗生素和生物燃料。在這項研究中，我們使用RSM和BBD來優(yōu)化枯草芽孢桿菌CGMCC5174發(fā)酵液營養(yǎng)成分組成配方，以提高微生物活產(chǎn)酶量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌CGMCC5174：由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品微生物團隊提供。

葡萄糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、木糖、(NH4)2SO4、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、鹽酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸錳(MnSO4)、硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈣(CaCl2)：均為分析純,上海鼎國生物技術(shù)有限公司；糖蜜(食品級)：購于山東傳承化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus生物顯微系統(tǒng) 日本Olympus公司；PB-10型酸度計 德國賽多利斯公司；MLS-3780高壓滅菌器 日本Sanyo公司；HZQ-Q振蕩培養(yǎng)箱、BCN-1360B 型無菌超凈工作臺 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DP-756P分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件

枯草芽孢桿菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、氯化鈉5 g/L，使用去離子水定容到1 L，搖動容器使物料全部溶解后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.4，放置高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌15 min。

在培養(yǎng)過程中，控制液體培養(yǎng)基初始pH值為7.4，裝液量為50 mL/250 mL，接種量為3.5 mL/dL，放入振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時間14 h后開展后續(xù)試驗。

1.3.2 發(fā)酵液粗酶產(chǎn)品的制備

取發(fā)酵完畢的枯草芽孢桿菌CGMCC5174發(fā)酵液，4500 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，添加(NH4)2SO4至溶液飽和度為85%，4 ℃冷藏保存12 h，9000 r/min離心30 min，取底部沉淀放于pH 6.0的磷酸緩沖液中，使用截留分子量7～1.4 kDa的透析袋在4 ℃冷藏溫度下透析16 h，將透析液冷凍干燥后，得到枯草芽孢桿菌CGMCC5174粗酶粉。

1.3.3 淀粉酶活力測定方法[14]

采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24401-2009的測定方法，略作改動。

稱取上述制得的粗酶凍干粉末1 g，用pH 6.0的磷酸緩沖液充分溶解，定容至100 mL，配制20 g/L可溶性淀粉溶液后，取出20 mL放于比色管中，加入磷酸緩沖液(pH 6.0)5 mL，放于振蕩器振蕩5 min，置于60 ℃水浴鍋中恒溫預(yù)熱10 min。加入1 mL稀釋好倍數(shù)的待測酶液，迅速搖勻，準(zhǔn)確計時反應(yīng)5 min。吸取1 mL反應(yīng)液迅速加入預(yù)先裝有0.5 mL鹽酸溶液(0.1 mol/L)和5 mL稀碘液的比色管中，快速振蕩搖勻，以0.5 mL鹽酸溶液(0.1 mol/L)和5 mL稀碘液混合液為空白對照，在分光光度計在660 nm波長下，使用10 mm比色皿測定吸光度(A)。按照GB/T 24401-2009附錄A(吸光度與測試α-淀粉酶濃度對照表)，根據(jù)吸光度值，計算待測液中酶類的濃度。

根據(jù)下式計算得到枯草芽孢桿菌CGMCC5174粗酶粉中α-淀粉酶酶活(c)。

X=c×n。

式中：X為枯草芽孢桿菌粗酶粉酶活力(U/g)；c為待測液中的酶活力(U/g)；n為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基碳源及添加量優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的選擇根據(jù)前期參考文獻[15]中條件選擇葡萄糖、甘油、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、木糖、糖蜜。以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對照，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

選擇發(fā)酵液中酶活力最高的碳源為最佳碳源，改變液體培養(yǎng)基碳源添加量為5，10，15，20，25，30 g/L，培養(yǎng)基其他成分保待不變，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的酶活力。

1.3.5 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源及添加量優(yōu)化

以上述碳源優(yōu)化試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的選擇根據(jù)前期參考文獻[16]中條件選擇大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨，氮源添加量為15 g/L。以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對照，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

選擇相互不顯著、較優(yōu)的幾種氮源做氮源比例復(fù)合試驗，發(fā)酵培養(yǎng)基其他營養(yǎng)成分條件不變，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌的酶活力。以優(yōu)化比例的氮源為研究對象，發(fā)酵培養(yǎng)液其他營養(yǎng)成分不變，氮源總量分別為5，10，15，20，25，30 g/L，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)液無機鹽的優(yōu)化

以上述碳源和氮源優(yōu)化試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，無機鹽分別只添加磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸錳(MnSO4)、硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈣(CaCl2)中的一種，添加量為5 g/L，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基成分Plackett-Burman設(shè)計

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，用Minitab 19.0軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計，篩選出對枯草芽孢桿菌酶活力影響比較顯著的因素，發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌的酶活力。

1.3.8 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化成分最陡爬坡試驗

以上述篩選出的顯著性因素為試驗基礎(chǔ)，為進一步確定培養(yǎng)基組成成分，通過最陡爬坡試驗確定篩選出的顯著性試驗因素最佳使用區(qū)域。根據(jù)試驗顯著性正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計各個試驗因素的合理步長，增加合理試驗因素密集度，接近試驗結(jié)果理論上的最佳區(qū)域。發(fā)酵條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)工藝條件，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌CGMCC5174基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵液為對照，發(fā)酵培養(yǎng)后測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活力。

1.3.9 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面Box-Benhnken試驗設(shè)計

響應(yīng)面分析統(tǒng)計試驗法通過合理地選取試驗因素數(shù)據(jù)點和試驗因素選擇迭代策略，克服了傳統(tǒng)試驗設(shè)計統(tǒng)計方法的缺點，在對枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基成分優(yōu)化選擇過程中取得了快速的效果[17]。采用Minitab 19.0軟件根據(jù)上述優(yōu)化試驗結(jié)果設(shè)計，通過方差分析，依據(jù)二次多項式回歸方程繪制試驗結(jié)果響應(yīng)面分析法三維立體分析圖形，通過數(shù)據(jù)預(yù)測枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分理論最佳配方，并通過實際試驗進行驗證。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基碳源及添加量優(yōu)化

由圖1中A可知，當(dāng)發(fā)酵液的碳源是糖蜜時，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活最高，其次是葡萄糖和蔗糖。糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，其成分隨著不同的糖原料和加工條件的變化而變化，主要含有大量的可發(fā)酵糖和生長刺激因子。不但能滿足枯草芽孢桿菌生長繁殖的營養(yǎng)需求，還能刺激細(xì)菌大量分泌代謝產(chǎn)物[18]。其他單一碳源也能滿足細(xì)菌生長的需要，但效果與糖蜜發(fā)酵明顯不同，因此選擇糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源種類(A)及碳源添加量(B)對發(fā)酵液酶活的影響

由圖1中B可知，當(dāng)碳源添加量為15 g/L時，發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活最高，當(dāng)碳源濃度過低時，微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，造成發(fā)酵液中活菌分泌酶類產(chǎn)量較低。但碳源濃度過高時，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)反而抑制了菌體的生長和代謝產(chǎn)物的分泌；也可能與發(fā)酵液的整體黏度增大，影響到微生物生長過程中氧成分的吸收，導(dǎo)致活菌量降低，淀粉酶含量降低，故選擇碳源添加量為15 g/L。

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源及添加量優(yōu)化

氮源是微生物生長繁殖必不可少的營養(yǎng)元素，是微生物合成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要成分。因此，生長和培養(yǎng)環(huán)境中氮源的類型和數(shù)量對細(xì)菌的生長及生產(chǎn)代謝產(chǎn)物非常重要。由圖2中A可知，使用不同氮源的菌株的產(chǎn)酶活力明顯不同。試驗中觀察到有機氮源比無機氮源對枯草芽孢桿菌的生物合成代謝有明顯的促進作用。因此，選擇酵母粉和胰蛋白胨進行復(fù)合氮源配比試驗。由圖2中B可知，在上述兩個重要因素結(jié)合后，菌株的產(chǎn)酶活力增加,但選擇比例之間并無顯著差異。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇了復(fù)合有機氮比例和胰蛋白胨∶酵母粉為1∶2。

圖2 氮源種類(A)、比例(B)和添加量(C)對發(fā)酵液活菌量的影響

由圖2中C可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度的逐漸增加，通過消化分解利用氮源生長繁殖的菌株產(chǎn)酶活力也逐漸增加。當(dāng)有機氮源添加量為20 g/L時，發(fā)酵液中活的枯草芽孢桿菌酶活力最高。超過20 g/L時，酶活逐漸減少，含氮物質(zhì)濃度過高，開始抑制發(fā)酵液中微生物的生命活動進而導(dǎo)致酶活力快速降低。因此，氮源最佳的添加量為20 g/L。

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化

無機鹽一般作為菌體細(xì)胞重要組成成分和生理活性的參與者，在一定程度上對細(xì)菌的生長代謝有促進作用[19]。由圖3可知，單獨一種無機鹽對菌株產(chǎn)淀粉酶的顯著性影響中，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳顯著性較大，所以選擇上述無機鹽類進行后續(xù)發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)成分Plackett-Burman篩選試驗。

圖3 無機鹽種類對發(fā)酵液活菌量的影響Fig.3 Effects of inorganic salts' types on living bacteria amount of fermentation broth

續(xù) 表

2.4 培養(yǎng)基成分Plackett-Burman試驗

通過對上述培養(yǎng)基成分單因素試驗結(jié)果分析，確定了Plackett-Burman試驗設(shè)計所需的試驗數(shù)據(jù)，通過分析軟件統(tǒng)計篩選到對枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中活菌數(shù)有顯著性影響的因素，進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成。按照Minitab 19.0軟件設(shè)計，因子數(shù)9，次數(shù)20，試驗設(shè)計表與結(jié)果見表1。

表1 營養(yǎng)成分Plackett-Burman試驗設(shè)計表與結(jié)果

由表2可知，回歸分析模型的P值<0.05，表明該模型數(shù)據(jù)效果顯著。糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀的P值在置信區(qū)間95%內(nèi)小于0.05，該數(shù)據(jù)模型分析得出糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀這4種發(fā)酵培養(yǎng)基成分是影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶的顯著性因素，都為正效應(yīng)。由回歸模型方差分析可知，誤差占總誤差的百分比為98.01%，表明該試驗中98.01%的數(shù)據(jù)可以用上述模型解釋。

表2 營養(yǎng)成分Plackett-Burman設(shè)計回歸模型方差分析

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)最低添加量試驗結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗篩選出影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活的不顯著因素，即胰蛋白胨、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀，做營養(yǎng)成分最低添加量試驗，結(jié)果見表3。

表3 營養(yǎng)成分不顯著因素的最低添加量試驗

由表3可知，根據(jù)降低枯草芽孢桿菌實際生產(chǎn)成本和簡化培養(yǎng)基配制生產(chǎn)工藝的原則，選擇組成成分各影響因素下發(fā)酵液酶活量達到最大值所對應(yīng)的添加量為最低添加量，即胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈣 3 g/L、磷酸氫二鈉0 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)添加量最陡爬坡試驗結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗篩選出影響枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中酶活的顯著因素，即糖蜜、酵母粉、硫酸錳、磷酸二氫鉀。4個因素都為正效應(yīng)，按照試驗結(jié)果正負(fù)效應(yīng)設(shè)定最陡爬坡試驗，其他營養(yǎng)成分為上述最低添加量結(jié)果，即胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸氫二鈉0 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L。

由表4可知，當(dāng)糖蜜、酵母粉、硫酸錳和磷酸二氫鉀添加量分別為20，7，6，6 g/L時，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶活力最高，將其作為發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)添加量Box-Benhnken試驗的中心點，進一步優(yōu)化營養(yǎng)組合添加量。

表4 營養(yǎng)成分最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)添加量響應(yīng)面Box-Benhnken試驗設(shè)計

通過最陡爬坡試驗得到糖蜜20 g/L、酵母粉7 g/L、硫酸錳6 g/L和磷酸二氫鉀 6 g/L為適宜最佳點，以枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶活為響應(yīng)值進行三因素三水平Box-Benhnken試驗設(shè)計，見表5。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分配方為：胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L。以淀粉酶活為響應(yīng)值，利用Minitab軟件構(gòu)建了響應(yīng)面二次模型方程，以未編碼單位表示的回歸方程為Y=1976.92+47.58X1+16.48X2-6.65X3+24.75X4-2.72X12-37.94X22-20.19X32+0.16X42+1.88X1X2+4.31X1X3+3.19X1X4+1.00X2X3+3.94X2X4+2.00X3X4。

由表6可知，其中X1、X2和X4對響應(yīng)值有顯著性影響。失擬項檢驗P值為0.757>0.05，說明該模型與枯草芽孢桿菌實際培養(yǎng)發(fā)酵情況擬合度良好，可以預(yù)測發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的最佳條件。由響應(yīng)面分析預(yù)測枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶極大值所對應(yīng)的因素編碼值分別為0.997，0.2929，-0.0101，0.993，換算成實際值，分別是糖蜜24.985 g/L、酵母粉7.5858 g/L、硫酸錳5.9899 g/L、磷酸二氫鉀6.993 g/L。在此預(yù)測的最佳枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基下淀粉酶活可以達到2053.15 U/g。結(jié)合實際生產(chǎn)工作情況，調(diào)整枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基配方為糖蜜25.0 g/L、酵母粉7.6 g/L、硫酸錳6.0 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L，3次重復(fù)試驗平均發(fā)酵液中淀粉酶酶活為(2084±21)U/g。實際測量值與二次回歸方程預(yù)測值2053.15 U/g相吻合。

表6 回歸方程模型系數(shù)評估及其顯著性檢驗

3 結(jié)論

結(jié)合Plackett-Burman篩選試驗、營養(yǎng)組分最低添加量、最陡爬坡試驗和響應(yīng)面Box-Benhnken試驗方法建立了枯草芽孢桿菌發(fā)酵液淀粉酶活響應(yīng)模型。經(jīng)二次回歸方程的方差分析表明，模型具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性意義，與實際試驗值的擬合程度較好，適用于枯草芽孢桿菌淀粉酶活產(chǎn)量理論預(yù)測。用上述方程模型得到理論預(yù)測值為淀粉酶活2053.15 U/g，但優(yōu)化因素值不適合實際試驗使用。結(jié)合實際試驗條件，調(diào)整枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為糖蜜25.0 g/L、酵母粉7.6 g/L、硫酸錳6.0 g/L、磷酸二氫鉀7.0 g/L、胰蛋白胨8.0 g/L、氯化鈉 3 g/L、磷酸二氫鈉5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L，經(jīng)3次重復(fù)驗證試驗，平均發(fā)酵液淀粉酶酶活為(2084±21)U/g。調(diào)整后實測值與二次回歸方程預(yù)測值吻合良好。