反復(fù)妊娠失敗并發(fā)遺傳性易栓癥患者外周血NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與妊娠結(jié)局的關(guān)系分析

劉蘭云，吳正中，劉敏莉，連旭波

廣東省深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，廣東深圳 518700

反復(fù)妊娠失敗（RRF）主要是指復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及反復(fù)種植失敗[1-2]，該病的發(fā)生和凝血基因異常密切相關(guān)，大部分凝血基因異常患者由于無典型臨床癥狀而無法被及時檢出，然而在異常基因載體暴露于另一危險因素時，不良妊娠結(jié)局風(fēng)險隨之增加[3]。相對于孕婦而言，胚胎屬于一種半同種異體移植，孕婦免疫系統(tǒng)是否能有效識別并耐受胚胎抗原，對妊娠建立和維持具有直接影響作用， 其中母-胎界面更是妊娠建立以及維持關(guān)鍵性部位。 自然殺傷細(xì)胞（NK）于妊娠免疫調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，其中外周血NK 細(xì)胞具有一定的殺傷活性，可發(fā)揮較為理想的抗病毒以及抗腫瘤活性，可能參與了妊娠過程[4-5]。鑒于此，該文選取該院2017 年1 月—2020 年12 月收治的85 例RRF并發(fā)IT 患者為研究對象， 研究外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與妊娠結(jié)局的關(guān)系，以期為該病的診治提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院收治的85 例RRF 并發(fā)IT 患者納入研究。對所有受試者均進(jìn)行為期12 周的隨訪觀察，將其按照妊娠結(jié)局分為流產(chǎn)組41 例和正常妊娠組44 例。其中，流產(chǎn)組年齡26～44 歲，平均（36.45±6.12）歲；體質(zhì)指數(shù)（BMI）20～31 kg/m2，平均（24.98±3.56）kg/m2；疾病類型：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)30 例，反復(fù)種植失敗11 例。正常妊娠組年齡25～45 歲，平均（37.41±6.55）歲；BMI19～30 kg/m2，平均（24.93±4.12）kg/m2；疾病類型：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)34 例，反復(fù)種植失敗10 例。 兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：①均經(jīng)臨床相關(guān)診斷確診為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或反復(fù)種植失敗；②均并發(fā)IT；③年齡在25～45歲之間；④臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫婦存在染色體異常者；②排卵異常或（和）月經(jīng)異常者；③對抗凝藥物過敏者；④伴有子宮畸形、子宮肌瘤或?qū)m腔粘連等疾病者；⑤合并嚴(yán)重感染性疾病或自身免疫性疾病者；⑥合并惡性腫瘤者；⑦神志異常或合并精神疾病者；⑧正參與其他研究者。 入組人員均于同意書上簽字，醫(yī)院倫理委員會知悉并批準(zhǔn)。

1.2 方法

①外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)測定：選擇在所有受試者孕前及孕期每2 周時， 獲取肘靜脈血3 mL， 通過EDTA-K2 抗凝處理。分離獲取PBMCs 采用PBS 重復(fù)2 次洗滌處理。取100 μl 的PBMCs 加入含有1%胎牛血清以及0.09%疊氮鈉的PBS 液中重復(fù)2 次洗滌處理。分別取CD3-FITC、CD45-Percip 以及CD16/CE56-PE 加入其中完成染色處理。 之后繼續(xù)滴加250 μl 的Cytofix/Cytoperm 細(xì)胞固定/通透也實施固定、 通透處理。 最后以FASC Calibur 流式細(xì)胞儀（購自美國BD公司）完成免疫熒光和四色流式細(xì)胞分析。 ②外周血NK 細(xì)胞殺傷活性測定： 選擇在所有受試者孕前及孕期每2 周時，獲取肘靜脈血3 mL，通過EDTA-K2 抗凝處理。 取處于對數(shù)生長期的K562 以及處理完成的PBMCs 混合，兩者比例為50:1。 放置在37℃、5%二氧化碳條件下實施時長120 min 的孵育處理。 檢測前15 min 取碘化丙啶完成凋亡細(xì)胞的標(biāo)記。 最后借助FASC Calibur 流式細(xì)胞儀完成檢測和分析。 并通過K562 細(xì)胞凋亡率實現(xiàn)對NK 細(xì)胞殺傷活性的反映。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組不同孕周外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及外周血NK 細(xì)胞殺傷活性的差異。 分析RRF 并發(fā)IT患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與流產(chǎn)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t 檢驗；采用Spearman 相關(guān)性分析明確RRF 并發(fā)IT 患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與流產(chǎn)的關(guān)系。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同孕周外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評價比較

流產(chǎn)組孕0 周、孕6 周的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而兩組孕8 周、 孕12 周時的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者不同孕周外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評價比較[（±s），%]

表1 兩組患者不同孕周外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評價比較[（±s），%]

組別孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流產(chǎn)組（n=41）正常妊娠組（n=44）t 值P 值13.02±1.33 8.15±1.01 19.092<0.001 13.74±1.28 8.36±1.06 21.162<0.001 10.30±1.15 9.74±1.21 1.794 0.077 9.84±1.10 9.56±1.12 1.162 0.249

2.2 兩組不同孕周外周血NK 細(xì)胞殺傷活性評價

流產(chǎn)組孕0 周、孕6 周的外周血NK 細(xì)胞殺傷活性均高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；孕8 周、孕12 周時對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組患者不同孕周外周血NK 細(xì)胞殺傷活性評價比較（±s）

表2 兩組患者不同孕周外周血NK 細(xì)胞殺傷活性評價比較（±s）

組別孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流產(chǎn)組（n=41）正常妊娠組（n=44）t 值P 值19.12±3.94 15.03±2.17 5.982<0.001 17.42±3.11 13.49±2.04 6.934<0.001 14.13±2.10 13.55±2.14 1.260＞0.05 14.05±2.08 13.61±2.11 0.967＞0.05

2.3 RRF 并發(fā)IT 患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與流產(chǎn)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析可得，RRF 并發(fā)IT 患者孕0 周、 孕6 周的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、 外周血NK 細(xì)胞殺傷活性均和流產(chǎn)呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），見表3。

表3 RRF 并發(fā)IT 患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與流產(chǎn)的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，妊娠與同種異體移植類似，在著床過程中， 若胚胎無法被母體保護(hù)且遭受異常的母體免疫系統(tǒng)攻擊，則會引起胚胎種植失敗或?qū)е路磸?fù)流產(chǎn)[7-9]。隨著近年來相關(guān)研究的日益深入，免疫因素在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不孕以及反復(fù)胚胎移植失敗中起著至關(guān)重要的作用[10-11]。其中NK 細(xì)胞屬于機(jī)體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)重要組成部分之一，在所有外周血淋巴細(xì)胞中占比5%～10%，且在子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞中占比高達(dá)70%～90%，參與了人類的妊娠全過程[12]。 外周血NK 細(xì)胞以CD56dimCD16+為主，具備一定的殺傷活性，屬于人體抑制病毒入侵以及控制腫瘤擴(kuò)散的重要防線。 而子宮NK 細(xì)胞可通過合成、分泌大量的細(xì)胞因子，繼而對滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲、修復(fù)以及胚胎血供改善、促進(jìn)胎盤形成等起著調(diào)節(jié)作用[13]。故此，NK 細(xì)胞數(shù)量以及殺傷活性和妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。

該研究結(jié)果顯示，RRF 并發(fā)IT 患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與妊娠結(jié)局均密切相關(guān)。 究其原因，NK 細(xì)胞數(shù)量以及殺傷活性的異常升高會導(dǎo)致過度血管新生以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生， 進(jìn)一步導(dǎo)致母體對胚胎產(chǎn)生較大的排斥作用，從而增加流產(chǎn)的風(fēng)險[14]。此外， 經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析可得，RRF 并發(fā)IT 患者孕0 周、孕6 周的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、外周血NK 細(xì)胞殺傷活性均和流產(chǎn)呈正相關(guān)關(guān)系 （r=0.523、0.611、0.509、0.587，P<0.05）。相關(guān)學(xué)者在研究中得出，RRF 并發(fā)IT 患者孕0 周、6 周的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、外周血NK 細(xì)胞殺傷活性均和流產(chǎn)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.465、0.610、0.486、0.512，P<0.05）[15]， 與該文所得結(jié)論一致，提示外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≥12%可能預(yù)示孕婦的再次流產(chǎn)風(fēng)險較高。

綜上所述，RRF 并發(fā)IT 患者外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性與再次流產(chǎn)息息相關(guān)，且隨著孕0周和孕6 周的外周血NK 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及其殺傷活性增加，再次流產(chǎn)率升高。然而，該研究尚且存在一定的不足之處，如并未深入研究明確外周血細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及殺傷活性正常范圍，協(xié)助醫(yī)生選擇可能從相關(guān)治療中獲益的患者。