反復妊娠失敗并發遺傳性易栓癥患者外周血NK細胞百分數及其殺傷活性與妊娠結局的關系分析

劉蘭云，吳正中，劉敏莉，連旭波

廣東省深圳市龍崗區婦幼保健院產科，廣東深圳 518700

反復妊娠失敗（RRF）主要是指復發性流產以及反復種植失敗[1-2]，該病的發生和凝血基因異常密切相關，大部分凝血基因異常患者由于無典型臨床癥狀而無法被及時檢出，然而在異常基因載體暴露于另一危險因素時，不良妊娠結局風險隨之增加[3]。相對于孕婦而言，胚胎屬于一種半同種異體移植，孕婦免疫系統是否能有效識別并耐受胚胎抗原，對妊娠建立和維持具有直接影響作用， 其中母-胎界面更是妊娠建立以及維持關鍵性部位。 自然殺傷細胞（NK）于妊娠免疫調控中起著至關重要的作用，其中外周血NK 細胞具有一定的殺傷活性，可發揮較為理想的抗病毒以及抗腫瘤活性，可能參與了妊娠過程[4-5]。鑒于此，該文選取該院2017 年1 月—2020 年12 月收治的85 例RRF并發IT 患者為研究對象， 研究外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與妊娠結局的關系，以期為該病的診治提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院收治的85 例RRF 并發IT 患者納入研究。對所有受試者均進行為期12 周的隨訪觀察，將其按照妊娠結局分為流產組41 例和正常妊娠組44 例。其中，流產組年齡26～44 歲，平均（36.45±6.12）歲；體質指數（BMI）20～31 kg/m2，平均（24.98±3.56）kg/m2；疾病類型：復發性流產30 例，反復種植失敗11 例。正常妊娠組年齡25～45 歲，平均（37.41±6.55）歲；BMI19～30 kg/m2，平均（24.93±4.12）kg/m2；疾病類型：復發性流產34 例，反復種植失敗10 例。 兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準[6]：①均經臨床相關診斷確診為復發性流產或反復種植失敗；②均并發IT；③年齡在25～45歲之間；④臨床病歷資料完整。排除標準：①夫婦存在染色體異常者；②排卵異常或（和）月經異常者；③對抗凝藥物過敏者；④伴有子宮畸形、子宮肌瘤或宮腔粘連等疾病者；⑤合并嚴重感染性疾病或自身免疫性疾病者；⑥合并惡性腫瘤者；⑦神志異常或合并精神疾病者；⑧正參與其他研究者。 入組人員均于同意書上簽字，醫院倫理委員會知悉并批準。

1.2 方法

①外周血NK 細胞百分數測定：選擇在所有受試者孕前及孕期每2 周時， 獲取肘靜脈血3 mL， 通過EDTA-K2 抗凝處理。分離獲取PBMCs 采用PBS 重復2 次洗滌處理。取100 μl 的PBMCs 加入含有1%胎牛血清以及0.09%疊氮鈉的PBS 液中重復2 次洗滌處理。分別取CD3-FITC、CD45-Percip 以及CD16/CE56-PE 加入其中完成染色處理。 之后繼續滴加250 μl 的Cytofix/Cytoperm 細胞固定/通透也實施固定、 通透處理。 最后以FASC Calibur 流式細胞儀（購自美國BD公司）完成免疫熒光和四色流式細胞分析。 ②外周血NK 細胞殺傷活性測定： 選擇在所有受試者孕前及孕期每2 周時，獲取肘靜脈血3 mL，通過EDTA-K2 抗凝處理。 取處于對數生長期的K562 以及處理完成的PBMCs 混合，兩者比例為50:1。 放置在37℃、5%二氧化碳條件下實施時長120 min 的孵育處理。 檢測前15 min 取碘化丙啶完成凋亡細胞的標記。 最后借助FASC Calibur 流式細胞儀完成檢測和分析。 并通過K562 細胞凋亡率實現對NK 細胞殺傷活性的反映。

1.3 觀察指標

比較兩組不同孕周外周血NK 細胞百分數以及外周血NK 細胞殺傷活性的差異。 分析RRF 并發IT患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與流產的相關性。

1.4 統計方法

采用SPSS 24.0 統計學軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t 檢驗；采用Spearman 相關性分析明確RRF 并發IT 患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與流產的關系。 P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同孕周外周血NK 細胞百分數評價比較

流產組孕0 周、孕6 周的外周血NK 細胞百分數均高于正常妊娠組，差異有統計學意義（P<0.05）；而兩組孕8 周、 孕12 周時的外周血NK 細胞百分數對比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者不同孕周外周血NK 細胞百分數評價比較[（±s），%]

表1 兩組患者不同孕周外周血NK 細胞百分數評價比較[（±s），%]

組別孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流產組（n=41）正常妊娠組（n=44）t 值P 值13.02±1.33 8.15±1.01 19.092<0.001 13.74±1.28 8.36±1.06 21.162<0.001 10.30±1.15 9.74±1.21 1.794 0.077 9.84±1.10 9.56±1.12 1.162 0.249

2.2 兩組不同孕周外周血NK 細胞殺傷活性評價

流產組孕0 周、孕6 周的外周血NK 細胞殺傷活性均高于正常妊娠組，差異有統計學意義（P<0.05）；孕8 周、孕12 周時對比,差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組患者不同孕周外周血NK 細胞殺傷活性評價比較（±s）

表2 兩組患者不同孕周外周血NK 細胞殺傷活性評價比較（±s）

組別孕0 周孕6 周孕8 周孕12 周流產組（n=41）正常妊娠組（n=44）t 值P 值19.12±3.94 15.03±2.17 5.982<0.001 17.42±3.11 13.49±2.04 6.934<0.001 14.13±2.10 13.55±2.14 1.260＞0.05 14.05±2.08 13.61±2.11 0.967＞0.05

2.3 RRF 并發IT 患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與流產的相關性分析

經Spearman 相關性分析可得，RRF 并發IT 患者孕0 周、 孕6 周的外周血NK 細胞百分數、 外周血NK 細胞殺傷活性均和流產呈正相關關系（P<0.05），見表3。

表3 RRF 并發IT 患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與流產的相關性分析

3 討論

研究表明，妊娠與同種異體移植類似，在著床過程中， 若胚胎無法被母體保護且遭受異常的母體免疫系統攻擊，則會引起胚胎種植失敗或導致反復流產[7-9]。隨著近年來相關研究的日益深入，免疫因素在復發性流產、不孕以及反復胚胎移植失敗中起著至關重要的作用[10-11]。其中NK 細胞屬于機體內固有免疫系統重要組成部分之一，在所有外周血淋巴細胞中占比5%～10%，且在子宮內膜淋巴細胞中占比高達70%～90%，參與了人類的妊娠全過程[12]。 外周血NK 細胞以CD56dimCD16+為主，具備一定的殺傷活性，屬于人體抑制病毒入侵以及控制腫瘤擴散的重要防線。 而子宮NK 細胞可通過合成、分泌大量的細胞因子，繼而對滋養層細胞的侵襲、修復以及胚胎血供改善、促進胎盤形成等起著調節作用[13]。故此，NK 細胞數量以及殺傷活性和妊娠結局的相關性研究已成為國內外關注的熱點。

該研究結果顯示，RRF 并發IT 患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與妊娠結局均密切相關。 究其原因，NK 細胞數量以及殺傷活性的異常升高會導致過度血管新生以及炎癥反應的發生， 進一步導致母體對胚胎產生較大的排斥作用，從而增加流產的風險[14]。此外， 經Spearman 相關性分析可得，RRF 并發IT 患者孕0 周、孕6 周的外周血NK 細胞百分數、外周血NK 細胞殺傷活性均和流產呈正相關關系 （r=0.523、0.611、0.509、0.587，P<0.05）。相關學者在研究中得出，RRF 并發IT 患者孕0 周、6 周的外周血NK 細胞百分數、外周血NK 細胞殺傷活性均和流產呈正相關關系（r=0.465、0.610、0.486、0.512，P<0.05）[15]， 與該文所得結論一致，提示外周血NK 細胞百分數≥12%可能預示孕婦的再次流產風險較高。

綜上所述，RRF 并發IT 患者外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性與再次流產息息相關，且隨著孕0周和孕6 周的外周血NK 細胞百分數及其殺傷活性增加，再次流產率升高。然而，該研究尚且存在一定的不足之處，如并未深入研究明確外周血細胞百分數以及殺傷活性正常范圍，協助醫生選擇可能從相關治療中獲益的患者。