口蹄疫滅活疫苗保存及穩定性研究

劉國民，高日明，尚 策，宋慶慶，王 凱，陳炳全，朱修澤

（金宇保靈生物藥品有限公司，內蒙古 呼和浩特 010030）

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、穩定性決定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是無囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度比較敏感，當pH變化或溫度升高時完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低，生產中如何保護146S抗原完整性又要保證疫苗純度，兩者關系是工藝攻關難點，完整病毒粒子配合優質佐劑，刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生產是系統工程，包括細胞培養、病毒放大生產、純化濃縮、分裝乳化、保存、使用等工序。臨床使用時，合格的疫苗必須具備安全、高效、均一、穩定的特性；生產過程中采用合理的保存溫度和濃度，有助于延長病毒的保存期和維持較高的抗原水平，對生產中抗原的保存具有重要意義。本文通過對不同毒株熱穩定實驗、半成品不同溫度、濃度下146S變化、同時通過成品疫苗保存期實驗及挑戰實驗等證明不同的口蹄疫毒株對溫度敏感性不同，半成品、成品疫苗對溫度、酸堿度比較敏感，2~8℃是成品疫苗最佳保存條件，希望本文研究結果對疫苗穩定性方面研究，有一定指導作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液

分別收集培養好的A/WH/09毒株液、O/MYA98毒株液、OR/80毒株液及OZK/93毒株液，各取1 000 mL備用。

1.2 口蹄疫半成品原液及濃縮液

A/WH/09、O/MYA98口蹄疫滅活半成品原液各1 000 mL，由金宇保靈公司生產部提供。

1.3 口蹄疫成品滅活疫苗

OA型口蹄疫滅活成品疫苗，數量20瓶由金宇保靈公司生產部提供。

1.4儀器與試劑

CO2培養箱、96孔板、培養瓶、DMEM營養液、微量濾器、凍存管、鋁制方箱，高壓鍋或水浴鍋等、206佐劑、超速冷凍離心機，紫外分光光度計，生物安全柜，玻璃容器，移液器等；2～8℃冰箱；-20℃冷凍冰箱；BHK21細胞。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株熱穩定性實驗

將A/WH/09毒株、O/MYA98毒株、OR/80毒株及OZK/93毒株病毒樣品，先進行批量解凍，將毒液分裝成10 mL離心管12只，將不同口蹄疫毒株在90℃熱水浴鍋中滅活1～8 min，檢測TCID50，并記錄數據，主要考察口蹄疫毒株對溫度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S影響實驗

隨機抽取本公司生產部滅活抗原液及其相應批號的10倍濃縮純化液，分別取樣進行初始樣品146S含量的測定；將原液樣和10倍濃縮后樣液分裝，20 mL/瓶，每種樣品分2組，分別在-20℃和4℃冰箱中保存7個月，每月定期各取出1個樣品分別進行146S的測定。

2.3 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復凍融挑戰實驗

將同批次的20瓶OA型口蹄疫滅活成品疫苗分成2組，一組2～8℃保存12個月，每月抽檢一瓶；另一組做-20℃挑戰實驗，保存8瓶并反復凍融5次，凍融后檢測抗原含量。

3 結果

3.1 不同口蹄疫毒株熱穩定性實驗

從表1、圖1數據分析可知：A/WH/09毒株的溫度穩定值最低，說明A/WH/09毒株對溫度比較敏感，弱于其他毒株，而O/MYA98、OZK/93在90℃條件下裂解8 min后，檢測不到有效病毒，說明O/MYA98、OZK/93毒株比較穩定。

圖1 不同口蹄疫毒株對90℃熱水浴穩定性實驗

表1 90℃熱水浴對不同口蹄疫毒株的穩定性實驗（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品原液、濃縮液在4℃和-20℃條件下保存期實驗

從表2、圖2、圖3數據分析可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7個月中，完整病毒146S粒子的含量均有所下降。4℃保存條件下，原液樣和濃縮樣完整病毒146S粒子的降解分別為27.5%、12.3 %；-20℃保存條件下，其降解率分別為87.5%、92.4%。從本實驗數據證明，4℃比-20℃保存條件更有利于抗原的保存，濃度對抗原保存影響不顯著。

圖2 原液樣品1-7月146S變化曲線

圖3 濃縮后樣品1-7月146S變化曲線

表2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下對完整病毒146 S檢測結果 μg/mL

3.3口蹄疫成品疫苗2～8℃保存期實驗

從表3、圖4數據可知，口蹄疫 A 型、 O型滅活疫苗在2～8℃分別放置 12 個月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測146S含量，結果發現146S抗原含量基本沒有變化,說明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整。

圖4 口蹄疫滅活疫苗在2～8℃保存期實驗

表3 口蹄疫O型、A 型滅活疫苗保存期實驗

3.4 口蹄疫滅活疫苗反復凍融挑戰實驗

從表4、圖5數據可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復凍融抗原損失10%～20%左右，5次反復凍融后，抗原損失50%左右，因此在保管疫苗時盡量不要凍融。凍融后的疫苗堅決不能使用，因為完整病毒粒子146S已經裂解為無效的12S五聚體。

圖5 口蹄疫O型、A型滅活疫苗反復凍融后146s抗原含量變化(μg/mL)

表4 口蹄疫O型、A型滅活疫苗反復凍融后146S變化

4 討論

4.1 不同口蹄疫毒株熱穩定性實驗

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S粒子）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、穩定性決定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是無囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度等物理、化學物質比較敏感，如果保存不當、pH變化或溫度升高時，完整病毒146S容易分解為五聚體即12S。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低，因此工藝控制及保護完整病毒粒子不降解是各個生產企業的絕密技術，如口蹄疫病毒的純化、濃縮、保存技術都是口蹄疫生產中很難突破的技術，生產中如何保護146S 抗原完整性又要保證疫苗純度，兩者關系是工藝攻關難點，完整病毒粒子配合優質佐劑，刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控作用。

4.2 口蹄疫半成品原液、濃縮液在4℃和-20℃條件下保存期實驗

146S是指口蹄疫病毒在繁殖子代病毒過程中，由病毒衣殼和基因組共同組成的完整粒子，不是所有的抗原都能產生有效抗體，能刺激機體產生有效抗體的抗原才稱為有效抗原，口蹄疫完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的沉降系數為146S，所以我們就用146S來代表口蹄疫疫苗的有效抗原。目前146S評價方法有蔗糖密度梯度離心法、 紫外分光光度計定量法、液相色譜儀定量法、ELISA 檢測法等4種檢測方法，但蔗糖密度梯度離心法是OIE推薦的金標準檢測方法，大部分疫苗生產企業用此方法進行定量添加抗原，因為完整的 146S 抗原上有口蹄疫病毒的所有中和位點，能有效刺激動物機體產生抗體，因此完整的146S粒子的濃度多少，可作為一項評價口蹄疫疫苗質量的標準。

4.3 口蹄疫疫苗抗原穩定性與免疫原性的關系

穩定的抗原、有效的佐劑是疫苗研究的重點和難點。滅活疫苗在長期儲存、加熱和微酸性環境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產物也被稱為12S，12S是一個由VP1，VP2，VP3組成的五聚體。因為五聚體之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環境下組氨酸會迅速發生質子化，釋放正電荷，通過靜電排斥作用引發粒子裂解，這正是口蹄疫疫苗不穩定的原因。由于146S粒子在酸性環境下分解成12S 粒子，而12S表面的免疫反應位點被隱藏或發生形變的緣故，使12S不具備任何免疫原性，無法激發機體產生抗體，降低了口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒會在高溫狀態下，使組合狀態的 12S 粒子轉化為分解狀態，因此口蹄疫疫苗不宜長期暴露在高溫狀態下，口蹄疫疫苗效力與口蹄疫滅活疫苗中的 146S 粒子數量有關，若是能夠確保 146S 粒子穩定不被分解，那么口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護，這也是口蹄疫滅活疫苗需2～8℃保存的機理。口蹄疫抗原穩定性差給口蹄疫疫苗的生產、儲存和應用帶來了很多困難，使用過程中必須全程冷鏈運輸以保護口蹄疫疫苗的免疫原性。

4.4 口蹄疫疫苗抗原保護劑、儲存、運輸

口蹄疫病毒抗原對酸和熱極其敏感，為了保證疫苗質量，生產商采取研發疫苗抗原保護劑，增加昂貴的冷鏈運輸系統，將優質疫苗送到用戶手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生產企業的難點，但金宇生物一直采用自主研發的UTM保護劑，從工藝技術上保障疫苗穩定性，從運輸環節上采用無死角的2～8℃冷鏈運輸，使客戶用上最好、最新鮮的疫苗。不論后續口蹄疫疫苗技術如何革新，對口蹄疫病毒粒子的完整性和穩定性研究，一直是廣大科技從業者長期努力和研究的方向。