基于網絡藥理學和分子對接研究丹芎活血片治療骨性關節炎的機制

郭晉言 梁銘林 黃煜智 曾豪杰 陳倩文 楊 春▲ 杜以寬

1.廣東醫科大學干細胞與再生組織工程重點實驗室，廣東東莞 523808；2.廣東省東莞市人民醫院中心實驗室，廣東東莞 523059

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是由于關節先天性異常、關節畸形等因素引起關節軟骨退化損傷[1]，主要通過口服藥物與手術緩解癥狀[2]，但治療的相關不良反應多[3]。既往研究[4]證實，中藥在治療OA、改善生存質量、明顯延長無病生存期等方面發揮積極作用。骨關節炎屬中醫學 “痹證” 或 “瘺證” 范疇[5]，正氣不足是其發病內因，濕、熱、寒、風是其發病外因[6]，治療以補肝腎、盈氣血為主。

丹芎活血片是蔡立民教授根據多年臨床辨證經驗提出的成方，其采用活血化瘀、固正扶陽的方法，正切中病機，研究顯示其抗凝效果確切，能通過促進局部的血液循環改善關節功能，顯著提高患者生存質量，但具體作用機制仍需進一步研究[7]，而采用單一的機制研究不能體現丹芎活血片治療OA 的整體性與多向性。網絡藥理學將藥物作用靶點和疾病靶點結合，建立疾病、靶點、藥物及通路之間的相互作用網絡，從而全面系統地分析藥物的作用機制[8]。因此本研究對丹芎活血片進行網絡藥理學研究，旨在為后續基礎與臨床研究提供分子機制基礎。

1 材料與方法

1.1 篩選丹芎活血片的成分與靶標

檢索TCMID 數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和SymMap 數據庫（https://www.symmap.org/），收集既往文獻中當歸[9]6 個成分、丹參[10]6 個成分、川芎[11]6 個成分、蘇木[12]4 個成分、土鱉蟲[13]5 個成分、血竭[14]6個成分、澤蘭[15]5 個成分、路路通[16]5 個成分、粉防己[17]1 個成分、桑枝[18]6 個成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件，得到成分并查詢對應的靶點。

1.2 篩選OA 的靶點

在Gene Cards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）等數據庫檢索 “Osteoarthritis”，獲得疾病靶點。

1.3 “中藥-成分-靶點” 網絡的構建

用Venny 對藥物與疾病靶點取交集獲得共同靶點，并在Cytoscape 3.7.2 構建 “中藥-成分-靶點” 網絡。采用Cytoscape 分析網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質交互網絡的構建

在STRING（https://string-db.org/）構建蛋白質-蛋白質交互（protein-protein interaction，PPI）網絡，獲得核心網絡模塊。

1.5 基因本體與京都基因與基因組百科全書途徑富集分析

借助DAVID 數據庫（https://DAVID.ncifcrf.gov/）進行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書途徑富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment，KEGG）分析，用于預測藥物治療OA 的生物過程。

1.6 “成分-靶點-通路” 網絡的構建

將成分、靶點和信號通路導入微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn）構建網絡圖，篩選排名前5位的成分進行分子對接驗證。

1.7 有效成分-靶點分子對接

利用LEDOCK 分子對接軟件，將有效成分與核心靶點進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 活性成分獲取

篩選得到丹芎活血片的活性化合物50 個（表1），對應的靶點1128 個。

表1 丹芎活血片的成分信息表

2.2 疾病靶點

篩選得到丹芎活血片的疾病靶點774 個。用Venny 取藥病靶點交集，得到50 個共同靶點，見圖1。

圖1 藥物與OA 靶點交集的韋恩圖

2.3 “藥物-化合物-靶點” 網絡圖

該網絡圖度值排名前5 的有效成分為槲皮素，山柰酚，姜黃素，阿魏酸，藁本內酯（圖2），這可能是治療OA 的活性成分。

圖2 “藥物-化合物-靶點” 網絡

2.4 PPI 結果

在閾值≥0.7 中，Cytoscape 3.7.2 篩選出STAT3、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、JUN 有密切聯系；在0.9 的高度閾值中，篩選顯示STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 是核心成分（圖3），以此作為分子對接的靶點。

圖3 PPI 網絡圖

2.5 GO 和KEGG

本研究中，GO 結果顯示，分子功能富集于聚合酶Ⅱ啟動子轉錄陽性、細胞質、蛋白質結合等（P<0.05）（圖4，封四）。KEGG 結果顯示，在癌癥、乙型肝炎、核因 子κB （nuclear factor κB，NF -κB）、PI3K -Akt 和JAK-STAT 信號通路中富集（圖5）。

圖4 GO分析圖（見內文第5頁）

圖5 KEGG 分析圖

2.6 “成分-靶點-通路” 網絡圖

將成分、靶點、前10 條通路使用Cytoscape 3.7.2構建 “成分-靶點-通路” 網絡圖。前5 個成分為阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸、姜黃素、山柰酚（圖6），以此作為分子對接的成分。

圖6 “成分-靶點-通路” 網絡圖

2.7 分子對接

以6 個核心靶點與5 個有效成分進行分子對接（圖7），結果顯示，STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 的結合能均小于-5 kJ/mol，說明有較好的結合活性。

圖7 藥物和靶點的分子對接過程圖

3 討論

本研究通過網絡分析，得到的槲皮素、山柰酚、姜黃素、阿魏酸已有文獻證明對OA 有療效，并通過PPI獲得STAT3、MMP、IL-6、TNF、JUN。其中IL-6 嚴重破壞關節軟骨組織平衡，而TNF-α 可以阻斷軟骨膠原的合成，導致軟骨基質降解和破壞[19]。槲皮素可降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌水平，并在蛋白水平下

調Nlrp3、caspase-1、proIL-1β 和IL-1β 的表達[20]，表現其抗氧化性和抗炎活性，從而治療OA[21]。山柰酚可抑制bFGF-FGFR3-RSK2 信號抑制類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞的增殖和遷移，抑制活性T 細胞介質的炎癥細胞因子（如IL-17、IL-21 和TNF-α）的釋放[22]，而Tanideh 等[23]在利用山柰酚治療前交叉韌帶橫切術（anterior cruciate ligament transection，ACLT）誘導的大鼠的實驗中，發現大鼠體內的MMP-13、MMP-3、TNF-α、IL-1 明顯降低。姜黃素同樣可以充當抗炎藥，抑制軟骨細胞中NF-κB 介導的IL-1β/TNF-α 分解代謝信號通路[24]，由此可見，丹芎活血片中的活性成分能從多方面抑制關節病變的過程，從而發揮治療OA 的作用。

KEGG 結果顯示，調節PI3K/AKT 信號通路可以治療OA。OA 患者中miR-146a-5P 表達增加，促進軟骨細胞凋亡和炎癥反應[25]。在OA 大鼠模型中，山柰酚抑制了miR-146a 和Decorin 在軟骨組織中的表達，從而激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路，與KEGG 的結果一致[26]。NF-κB 信號通路也與治療OA 相關，槲皮素通過抑制TNF-α 和NF-κB 之間的正反饋調節，從而起到治療OA 的作用[27]。為了客觀展示藥物治療OA的分子機制，本研究結合了藥物與疾病的映射靶點和信號通路的結果，繪制了科學假說圖（圖8，封四），為全面深入地了解作用機制奠定了基礎。

本研究借助網絡藥理學技術，預測槲皮素、山柰酚、姜黃素、阿魏酸通過靶向PI3K/Akt、NF-κB 信號通路中的TNF、NF-κB、AKT 等分子起作用，從分子水平方向揭示了丹芎活血片治療OA 的潛在作用機制，為后期藥物研發及疾病治療提供一定理論依據。