不同產地枸杞品質差異研究

李曼祎，沈天辰，劉春鳳，鄭飛云，鈕成拓，李崎，王金晶*

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室(生物工程學院)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 釀酒科學與技術實驗室，江蘇 無錫，214122)

枸杞由于其藥食同源的特性被廣泛應用于保健食品加工，其富含的甜菜堿，枸杞色素及枸杞多糖具有重要的生物學功能[1]，如抑制癌細胞的增殖[2]、提高人體的免疫力、減少肝臟損傷[3]等。中國是枸杞的主要生產國和消費國，寧夏、內蒙古西部、新疆、青海為枸杞主要產區。2009—2018年，枸杞的年產量從128 200 t增加到451 000 t。由于不同產區之間土壤特性、氣候條件和耕作方法不同，果實質量、重量、糖含量和活性物質存在差異，從而導致產地之間的風味差異[4]。雖然大面積的種植區提高了枸杞產量，但也造成市面上枸杞質量不一，魚龍混雜的現狀。由于糧食市場的全球化，人們對農產品的溯源越來越關注[5]，部分國家制定了確保產品地理標志質量的政策。自2006年以來，中國已實施了有關農產品原產地的管理法，以改善原產地條件并確保原產地的質量安全。因此，開發一種快速鑒別產地的方法檢測枸杞的地理來源，對于規范市場和控制質量均具有重要意義。色譜-離子遷移譜法(headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，HS-GC-IMS)是一種快速分離和鑒定風味化合物的新方法，無需預處理即可以較低的檢測限進行快速分析，在食品質量鑒別，溯源及風味分析中起著重要的作用[6-7]，如區分松茸不同部位的風味差異，椰子油等級及鑒定伊比利亞火腿真偽等[8-10]。

如今消費者對產地溯源愈加重視，因此本研究通過對不同產區枸杞化學成分的測定，結合氣相離子色譜及偏最小二乘法判別(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)對4個主要產區枸杞進行區分，旨在分析地理環境對枸杞品質的影響，確定不同產區枸杞中含量差異較大的揮發性風味化合物，為枸杞產品的產地鑒定提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

5%苯酚溶液、硫酸、無水乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等，國藥試劑。

2020年7月，從寧夏回族自治區中衛縣區域(n=7)、新疆維吾爾自治區精河縣區域(n=5)、青海省柴達木盆地區域(n=7)和內蒙古西部烏拉特前旗區域(n=5)的4個主要產區范圍內收集枸杞樣品，有關收集地區的地理位置相關信息匯總至表1。

表1 中國枸杞產區地理位置Table 1 Location information of wolfberry region in China

1.2 儀器與設備

PL2002電子天平、AL204分析天平、FE20精密數顯pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；UV2300紫外-可見光分光光度計，上海天美公司；Kjeltec8400全自動凱式定氮儀，美國FOSS公司；FlavourSpec 1H1-00053型頂空氣相-離子遷移譜儀，德國G.A.S.公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同產地枸杞化學成分測定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品水分的測定》采用直接干燥法進行測定；蛋白質含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》采用凱式定氮法進行測定；總糖含量參照GB/T 0782—2006《食品安全國家標準 食品中總糖的測定》采用滴定法進行測定；枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素含量均參照吳有鋒等[11]經超聲提取后采用分光光度法進行測定。

1.3.2 GC-IMS測定條件

根據FANG等[12]的方法稍作修改。樣品預處理：所有樣品(水分含量相似)用超純水洗滌3次后以料水筆1∶3(g∶mL)浸泡2 h，勻漿，取2 mL枸杞汁放入20 mL頂空瓶中待測。GC條件：柱溫起始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min加熱至125 ℃，保持2 min后以15 ℃/min加熱至160 ℃；載氣為純度≥99.999%氮氣。自動頂空進樣器的條件：溫育溫度80 ℃，溫育時間15 min。在不分流進樣模式下于85 ℃注入1 000 μL等分試樣；噴霧方式∶頂空噴霧；加熱方式∶搖動加熱；搖動速度∶600 r/min；IMS的檢測條件：漂移管的長度98 mm，溫度為45 ℃；漂移氣體為高純N2，純度≥99.999%。流速：150 mL/min，線性電壓管:500 V/cm；輻射源:β射線(tri，3H)；電離模式:正離子。

1.3.3 數據分析

使用LAV及 Reporter、Gallery Plot插件進行樣品分析，通過GC×IMS內置NIST數據庫和IMS數據庫對枸杞樣品中揮發性化合物進行定性。采用PLS-DA(Simca-p軟件)對風味數據進行建模，以確定不同區域中的特定標記。采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，P<0.05表示物質濃度存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同產地枸杞化學成分分析

各產地隨機挑選5份枸杞樣品進行化學成分的測定，各樣品具體理化指標及活性物質含量見表2，為便于比較不同產區間的成分差異，對各產區樣品進行顯著性差異分析，結果匯總于表3。由表3可知，不同地區樣品中水分、枸杞多糖、黃酮、總糖、蛋白質、類胡蘿卜素含量水平均在產區之間表現出一定差異(P<0.05)。就水分而言，寧夏及內蒙古枸杞較為干燥，水分含量在10%～12%，兩產區之間無顯著差異。新疆枸杞由于顆粒較大導致曬制結束后殘留水分較多，水分含量達到(14.83±0.97)%。四產地枸杞樣品的蛋白質含量均處于較高水平，在10%～15%波動，與之前研究報道的結果相似，也側面說明枸杞是一種高蛋白質的藥食兩用資源。糖是枸杞風味重要的組成成分，糖分的積累受不同生態因子及蔗糖代謝相關酶的影響[13]，同時糖分也調控其生長成熟中眾多物質的代謝，大部分果實中揮發性香氣物質是果實碳水化合物次生代謝的重要產物[14]，各產區總糖含量由高至低為：青海>新疆>寧夏>內蒙古。有研究表明蘋果果實從幼果期開始適度干旱脅迫可以提高果實蔗糖及果糖含量[15]，柴達木盆地年均降水量為20～80 mm，約為內蒙古西部的20%～50%，青海產區與內蒙古產區相比，海拔較高，晝夜溫差增大，中度干旱的環境促進了該產區枸杞糖分的積累。但過高的含糖量會影響枸杞晾曬制干過程，使枸杞變得潮濕黏軟，不易貯藏[16]。經上述理化指標綜合比較，內蒙與寧夏的枸杞更易貯藏及運輸。

表2 中國不同產地枸杞化學成分分析(n=3，mean±SD)Table 2 Chemical constituents of wolfberry from different region of China(n=3，mean±SD)

表3 中國不同產地枸杞化學成分統計分析Table 3 Analysis of chemical constituents of wolfberry from different region of China

黃酮廣泛存在于自然界植物及漿果中，其作為枸杞的次生代謝物在保健功效中具有重要作用，可抗腫瘤、抗氧化、降低血脂等[17]，除枸杞外銀杏葉片、大豆、葡萄及菊科植物中均含有大量黃酮類化合物。寧夏產區枸杞黃酮含量最高，達到(0.44±0.03)%，同一產區間并無顯著差異。有研究表明土壤中氮及磷元素的缺乏會增強MYBb、bHLH轉錄因子表達，提高CHS、CHI基因表達量進而促進作物體內黃酮合成[18-19]，寧夏土質中氮、磷及有機質含量較低，相比較其他產區其土壤條件更利于枸杞中黃酮的積累。枸杞多糖是枸杞中主要的功能性物質，可以減輕高脂帶來的內臟損傷。研究結果表明，不同產區間枸杞多糖含量差異較大，青海產區枸杞的多糖含量最高，其次為寧夏產區，兩產區緯度相近但海拔差距明顯，海拔升高則溫度降低，光照強度及時間增加，晝夜溫差增大，利于枸杞中多糖的富集，與崔治家等[20]研究結果相符。而內蒙古相比寧夏產區，海拔相似但緯度差異較大，寧夏產區年均溫度更高，利于多糖的積累。由此可以看出枸杞多糖含量與地理位置及氣候環境密切相關，日照時間的增加及氣溫的升高均有利于枸杞品質的提升。類胡蘿卜素為存在光合植物中的天然色素，具有保護眼部、預防心腦血管疾病等重要保健功能，辣椒、柑橘及桃果實均含有大量類胡蘿卜素。同一產區內類胡蘿卜素含量波動較大，新疆產區的類胡蘿卜素含量最高，為(227.85±22.91) g/L，內蒙古產區樣品最低，為(187.55±26.37)g/L。綜上可以看出中國主要產區的枸杞品質存在一定差異，寧夏及青海產區地理環境對黃酮及多糖的積累有一定優勢，產區的生態條件包括溫度、光照、降水對道地性藥材枸杞的功能性物質成分及總糖含量影響較大，選取枸杞栽培區時應綜合考慮各環境因子對枸杞品質的影響。

2.2 不同產地枸杞揮發性物質的差異

果實風味極大程度上受到產區環境影響，不同緯度地區植物的化學成分不同[21]，在光照時間、晝夜溫差、降水量以及氣溫的綜合作用下形成產區間的風味差異。利用HS-GC-IMS鑒定不同產區中枸杞的揮發性物質，圖1(以內蒙古枸杞樣品為例)中光譜代表枸杞樣品的總揮發性化合物，可以看出大多數信號峰值位于1.0～1.5 s的漂移時間和400～1 400 s的保留時間內。IMS檢測依賴于由β電離產生的空氣簇離子與分析物之間的快速離子反應。因此，HS-GC-IMS分析對痕量物質的檢測更加敏感，除可以準確鑒定揮發性化合物外還可以建立樣品完整的指紋圖譜[22]。如圖1所示，縱坐標代表氣相色譜的保留時間，橫坐標代表離子遷移時間。RIP峰(反應離子峰，橫坐標1.0處紅色豎線)兩側的每個點代表一種揮發性有機化合物。點的顏色深淺與該種化合物濃度有關，顏色越深則濃度越高。在4個產地枸杞樣品中共檢測到72個峰，通過IMS數據庫鑒定出36種揮發性化合物。由于濃度不同，一些揮發性化合物會在遷移過程中產生不同的產物離子，即同一種化合物的單體和二聚體[10]。不同產物離子的保留時間相同，但漂移時間不同，例如圖1中由黃色方框標出的己醛(a、a′)、(E)-2-己烯醛(b、b′)、1-戊醇(c、c′)、1-己醇(d、d′)、糠醛(e、e′)均可觀察到2個信號峰。

圖1 枸杞氣相離子遷移譜Fig.1 GC-IMS topographic plots of wolfberry

為更直觀地比較不同產地枸杞風味成分之間的差異，選擇內蒙古枸杞風味指紋圖譜作為參比，并以差異比較模式從其他樣品的光譜中扣除該參比。如果揮發性化合物濃度一致，則扣除后的背景為白色，紅色表示物質的濃度高于參比值，藍色表示物質的濃度低于參比值。如圖2所示，不同產地枸杞的揮發性化合物種類相似，但含量略有不同。大多數化合物的差異信號集中在400～500 s和1 000～1 200 s的保留時間內(由紅色方框圈出)。與參比相比較，其他三產區樣品的大部分信號在扣除后均為藍色，這表明內蒙古獨特的地理環境對某些化合物的積累起了正向作用，這些物質可能成為產地鑒定的關鍵物質。

圖2 枸杞樣品的GC-IMS差異圖譜Fig.2 The differences fingerprint of volatile compounds in wolfberry

2.3 不同地區枸杞揮發性物質的指紋圖譜

前期利用GC-IMS分析共鑒定出36種揮發性化合物，具體信息見表4，包括化合物名稱、CAS號、分子式、分子質量、漂移時間、保留指數和保留時間。圖3 為使用內置Gallery Plot插件生成不同產地枸杞的揮發性有機物(volatile organic compounds，VOCs)指紋圖譜，橫坐標為每種揮發性化合物的名稱，用以表征每個枸杞來源的完整VOCs信息，其中每行代表1個樣品采集的差異物質信號峰，每列代表不同枸杞樣品中相同VOCs的信號峰。其中右側化合物為產生地域性差異較大的16種化合物(紫色框內)，由圖3可以直觀觀察到來自不同地區的枸杞樣品中揮發性化合物的差異，并建立與每個產區相對應的特征指紋圖譜。

圖3 枸杞樣品揮發性香氣化合物指紋圖譜Fig.3 The fingerprint of volatile compounds of wolfberry

表4 特征峰對應化合物Table 4 Volatile compounds of wolfberry identified by GC-IMS

鑒定出的風味化合物可大致分為酮類、醛類、酯類、醇類、酸類及萜烯類。由于HS-GC-IMS對醛酮類物質檢測更加敏感，相比GC-MS方法能夠檢測到更多的醛酮類物質[23]。大部分醛酮類物質被描述為具有青草及木質香氣，有研究表明高海拔低氣溫更利于果實中醛酮類的積累[24]，青海在四產區中海拔最高，平均海拔為2 800 m，2-甲基丁醛、糠醛、己醛在該產區中濃度明顯增加，而在海拔較低的新疆和內蒙古產區枸杞中則表現出明顯的降低或缺失(紅色及黃色方框內)。目前枸杞中醛類風味物質合成機理尚未明確，但與枸杞同屬茄科的番茄果實中2-甲基丁醛合成積累與支鏈氨基酸合成途徑密切相關[25]，青海柴達木枸杞17種氨基酸含量均處于較高水平[26]，相比其他產區，前體物質異亮氨酸及亮氨酸含量的增加促進了該產區枸杞2-甲基丁醛的合成。青海產區醛類物質含量的增加使該產區枸杞可可、咖啡及青草氣味更明顯。酯類是成熟果實中重要的風味化合物，包含直鏈酯類及支鏈酯類2種，主要來源于脂肪酸和氨基酸途徑，其含量受果實成熟程度及采摘后貯藏溫度影響較大。在四產區的枸杞樣品中共檢測到3種酯類，分別為異丁酸甲酯、丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，表現為菠蘿香味及果香。其中丙酸乙酯含量在產區間有較大差別，丙酸乙酯為果香型化合物，在成熟草莓及杏果實中均可被檢測到。鑒定出的12種醇類物質中有8種在產區間差別較大，大部分醇類物質表現為青草香及甜香，但由于其氣味閾值較高，對果實整體風味貢獻相比醛類較低[27]，黃瓜及甜瓜中醇類化合物種類及含量較多。由圖4可知，內蒙古產區枸杞中1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、己醇(綠色方框內)的含量顯著增加，C5醇類的形成可能與有脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)參加的氧化反應有關[28]，LOX廣泛存在于谷物及蔬菜水果中，如水稻、黃瓜、桃果實等，其在己醛類及醇類風味化合物的合成代謝中具有重要作用。番茄果實中C5風味化合物的形成也被認為與LOX有關。內蒙古地處內陸的地理環境及土壤氣候更利于醇類的形成與積累，其中正丙醇為內蒙古產區枸杞的特有揮發性化合物可用于該產區枸杞的鑒定。萜烯類物質雖然含量低，但由于其閾值較低，也是水果中重要的助香化合物[29]。不同產地同一品種果實的萜烯類組成含量相似，本次研究中α-蒎烯的含量在四產地枸杞中也并無顯著區別，α-蒎烯作為代表性的單萜類化合物作為植物精油的主要成分，是枸杞果實香氣的重要來源。

2.4 不同地區枸杞PLS-DA模型分析

通過PLS-DA將風味數據進行降維處理，相比于PCA，PLS-DA在高維數據的可視化、判別分析與代謝變化有關的潛在代謝物方面更具優勢[30]。其中R2和Q2分別代表該模型的解釋性和預測性，R2和Q2值越接近于1則擬合越好。由圖4-a可知，枸杞樣品被大致分為四類，主成分1和主成分2的貢獻率分別為71.4%和8.45%，累積貢獻率達到79.85%，能夠反應不同產地枸杞差異性揮發性物質的總體狀態。模型擬合度較好，其中R2Y=0.847 4，Q2=0.715 1。此外，該模型經過交叉驗證的200次置換測試，并未出現過擬合現象。使用變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)分析來進一步確定可以有效區分產地的標記物質，其中VIP值是選擇潛在分類標記物的主要參數，代表特定標記與不同產地枸杞樣品的相關性。通常認為潛在標記的VIP得分應>1，>1.5則更佳[30]。圖4-b列出了16種化合物的VIP值，其中有5種物質VIP值>1且在不同產地中表現出顯著的濃度差異，分別為糠醛D(>1.5)，1-辛烯-3-醇，葉醇，2-甲基丁醛及異戊醛，可以認為是區分不同產地的關鍵性風味物質。

a-主成分分析；b-VIP值圖4 四個產地枸杞差異揮發性物質PLS-DA分析Fig.4 PLS-DA analysis of different volatile substances in wolfberry from four producing areas

3 結論

枸杞是中國最具地域性的漿果之一，本研究通過HS-GC-IMS分析了來自4個產地的枸杞中風味物質的差異，發現地理環境對其中的風味化合物的形成具有重要影響。不同產區枸杞中共鑒定出36種風味化合物，醛類及醇類化合物占比較大，16種物質濃度表現出顯著差異。且正丙醇為內蒙古地區枸杞中的特有物質，可作為地域性標記。通過VIP分析篩選出5種標記物質可用于區別枸杞產地，分別為糠醛(>1.5)、1-辛烯-3-醇、葉醇、2-甲基丁醛及異戊醛，通過標記性物質的含量差異分析，可以為鑒定其產品產地提供參考。但由于本次試驗樣本量有限，若進一步擴充樣本量則可以建立更優的模型用于枸杞的產地分類，且IMS數據庫還不夠完善，仍有部分物質無法鑒別，需通過其他技術進一步進行定性分析。