GNL3L通過MAPK通路促進結直腸癌的發生發展

張條條，許志華，徐昌隆

(溫州醫科大學附屬第二醫院消化內科，浙江 溫州 325000)

0 引言

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上最常見的癌癥之一[1]。在中國，結直腸癌的發病率和死亡率在所有癌癥中排名第四[2]。目前，根治性手術仍是結直腸癌唯一有效的治療方法，早期發現結直腸癌對患者的預后至關重要。約35%-55%的晚期結直腸癌患者出現肺、肝臟轉移[3,4]。總的來說，傳統治療方法(手術、放療、化療、中藥治療)療效不顯著。因此，臨床迫切需要新的治療靶點來治療結直腸癌。

GNL3L是一種含582個氨基酸的GTP結合核仁蛋白，在核仁前rRNA加工和細胞增殖中發揮作用[5-6]。在乳腺癌細胞MCF-7[7]中，GNL3L作為一種核細胞質穿梭蛋白，通過其C端的核輸出信號區能夠與出核因子1(Chromosome region maintenance1，CRM1)相互作用調節細胞周期。Thoompumkal等人報道GNL3L能與癌癥亮氨酸拉鏈下調因子1(Leucine zipper down-regulated in cancer-1，LDOC1)相互作用，并在腫瘤發生過程中通過NF-κB通路調控HEK293T細胞的增殖和凋亡[5]。

然而，關于針對GNL3L在結腸癌進展中作用的研究相對較少，其潛在機制尚不清楚。因此，本研究的目的是利用公共數據庫研究GNL3L在結直腸癌中的表達、功能和機制。我們的研究結果表明，GNL3L在結直腸癌組織中高表達并對預后有影響，并可能對MAPK信號通路產生影響。

1 材料和方法

1.1 公共數據庫檢測結直腸癌中GNL3L的表達水平

首先我們在GEPIA中檢索癌組織中GNL3L的表達情況，并比較結直腸癌與對照組的表達差異。然后，在CCLE中下載57個結直腸癌細胞系的GNL3L表達數據。接著，在GEO數據庫篩選12個微陣列的數據，樣本信息見表1。數據均來自2019年11月之前上傳的微陣列和RNA測序實驗。之后我們在R環境下應用RMA算法對原始GEO數據進行歸一化并轉換為表達值(v3.5.3)[8]。使用R的“sva”包來移除跨平臺的批處理效果。比較腫瘤組織和癌旁組織中GNL3L在單系列數據集和單平臺數據集的表達情況。最后采用標準化均值差法評估連續變量GNL3L的表達。當異質性(I2)＞50%時，將數據與隨機效應模型相結合。結果以森林圖的形式呈現。

表1 從GEO中選擇的數據集

1.2 GNL3L的臨床特征分析

我們從TCGA數據庫中提取GNL3L的表達數據及其對應的臨床信息。使用Perl軟件對每個表達式的重復數據進行平均，并進行均一化處理。結合TCGA提供的年齡、性別、腫瘤分期、組織學分級等數據進行單因素和多因素Cox分析。

1.3 生物學功能分析

通過GEPIA和Coexpedia在線工具篩選可能參與結直腸癌發展的GNL3L相關基因[9]。然后，利用DAVID 6.8進行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。

1.4 統計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。使用t檢驗進行兩組之間的比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GNL3L在結直腸癌組織和細胞系中過表達

TCGA數據庫中，GNL3L在結腸癌組織中過表達(見圖1A和B)。基于CCLE數據，GNL3L在不同類型結直腸癌細胞系中的表達水平與結直腸癌組織趨勢一致(見圖1C)。在12個GEO基因芯片中，結直腸癌組織中GNL3L的表達水平較對照組織明顯升高(見圖1D)。在同一平臺中去除批次無效應后也觀察到這一趨勢。綜合meta分析顯示，GNL3L在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織(SMD=2.20，95%置信區間(CI)：1.42-2.98；P＜0.001)(見圖2A)。此外，森林圖去除批次效應在結直腸癌組織中呈現一致的表達趨勢(SMD=2.10，95% CI：1.29-2.92，P＜0.001)(見圖2B)。

圖1 GNL3L在數據庫中的表達情況

圖2 GNL3L表達的森林圖

2.2 GNL3L在結直腸癌中的臨床價值評價

我們在TCGA中提取結直腸癌患者GNL3L的表達值及其臨床特征信息，發現GNL3L的表達和性別、淋巴結轉移、腫瘤組織密切相關(見表2)。然而，GNL3L與其他臨床參數沒有顯著關聯。這可能是由于樣本量不足。隨后，我們通過單因素Cox分析發現，GNL3L表達水平、年齡、TNM、腫瘤分期與預后顯著相關。同時，多因素分析顯示GNL3L表達水平、年齡、N分級、M分級可能是結直腸癌患者的獨立預后因素(見表3)。

表2 GNL3L的表達及與結直腸癌臨床病理特征的關系

表3 結直腸癌患者總生存期的Cox回歸模型分析

2.3 利用公共數據庫分析GNL3L的生物學功能

為了明確GNL3L潛在的生物學功能，我們分析了與GNL3L表達相關的基因表達變化。利用GEO和TCGA數據分別通過Coexpedia和GEPIA構建GNL3L共表達網絡。接著，利用DAVID工具對鑒定的共表達基因進行GO和KEGG通路富集分析(見圖3A和B)。KEGG通路分析顯示，富集最顯著的通路與“核糖體”“泛素介導的蛋白水解”“甲狀腺激素信號通路”“細胞周期”和“MAPK信號通路”相關。

圖3 GNL3L在結直腸癌中的生物學功能分析

3 討論

結直腸癌的發生發展是一個復雜的多步驟過程，可能受癌基因和抗癌基因之間的不平衡以及相關信號通路的改變所影響。然而，我們對結直腸癌的發展和發病機制的認識仍然不完整。因此，明確結直腸癌的分子機制，為結直腸癌靶向治療確定新的生物標志物是當務之急。GTP結合蛋白可水解三磷酸核苷酸，作為信號轉化器或分子開關，參與細胞信號傳導、細胞內運輸、增殖、分化和凋亡等關鍵細胞事件[7,10,11]。在人類疾病中已經觀察到異常的GTPase信號，包括許多不同類型的癌癥。人們對確定GTP結合蛋白在癌癥發展和進展中的潛在作用越來越感興趣。

GNL3L是GTP結合蛋白家族的成員，是脊椎動物核干細胞因子(Nuleostemin，NS)和GNL2的同源類似物。NS在胚胎神經干細胞中優先表達[12]，與NS一樣，GNL3L也參與細胞生長和增殖[13]。最近的一項分析發現，與配對的正常組織相比，各種腫瘤中GNL3L表達水平顯著升高，尤其是結直腸癌、食管癌和胃癌[14]。我們的結果與這個分析一致。TCGA、GEO和CCLE數據庫的數據顯示，結直腸癌中GNL3L的表達顯著升高。

然而，目前尚不清楚GNL3L如何促進結直腸癌，確定其潛在機制應是未來工作的重點。我們鑒定了與GNL3L共同表達的基因，并進行GO和KEGG富集分析，發現GNL3L的功能可能與MAPK信號通路有關(P=0.03)。MAPK通路在哺乳動物細胞中傳遞細胞內信號，引起炎癥反應和凋亡等生理反應[15,16]。Ras/Raf/MEK/ERK途徑是經典的信號轉導途徑，具有MAPKs的三級酶級聯反應[17]。ERK/MAPK通路的異常激活或失調容易導致細胞增殖和生長失控，導致惡性轉化和癌癥發展。有研究發現，Ras/Raf/MEK/ERK通路的激活有助于誘導血管內皮生長因子的表達，參與結直腸癌的腫瘤侵襲和轉移[18]。考慮到這些特性，我們認為GNL3L過表達可能影響MAPK信號通路，從而促進結直腸癌細胞增殖和生長。

綜上所述，我們的研究結果揭示了GNL3L在結直腸癌中過表達，并可能通過影響MAPK信號通路調節細胞增殖。這是GNL3L在結直腸癌發生發展中的致癌信號傳導的新機制，提示GNL3L是一種有前景的治療靶點。