不同酶輔助提取毛竹葉中黃酮的工藝研究*

唐 功，王柯然，朱 欣，朱晗燚

（阿壩師范學院資源與環(huán)境學院，四川 汶川 623002）

毛竹（學名：Phyllostachys heterocycla Mitford cv.Pubescens）是禾本科、剛竹屬單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，其竹葉中黃酮含量高，具有清熱除煩、生津利尿等功效，又名竹葉抗氧化劑，是一種高效的生物抗氧化劑。毛竹葉屬于易取材的自然資源，價格低、資源豐富。因此，將其用作黃酮的提取原料具有很大的優(yōu)勢。

目前從竹葉中提取黃酮的方法查閱文獻有：直接提取法、熱回流法、堿溶液提取法[1-3]等。本實驗主要以汶川縣水磨鎮(zhèn)產(chǎn)的毛竹葉為材料，采取乙醇熱回流提取法[4-5]，該提取法具有節(jié)省溶劑用量、操作簡單等優(yōu)點，同時本實驗還輔助纖維素酶和果膠酶[6]，可提高提取率。運用紫外可見分光光度計[7]測定其含量，此方法操作簡單方便，結(jié)果準確可靠，為酶法輔助提取毛竹葉中黃酮的研究提供一定的理論參考。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

纖維素酶：50000U/g（成都市科龍化工有限公司）。

果膠酶：50000U/g（成都市科龍化工有限公司）UV-1800PC 型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程

毛竹葉50℃下烘干24h→粉碎→過40 目篩→纖維素酶、果膠酶預處理→75%乙醇加熱回流→抽濾得到濾液→蒸發(fā)濃縮。

1.2.2 操作步驟

稱取毛竹葉粉4g 于燒杯中，加40mL 蒸餾水，水浴加熱至50℃，加入試驗用酶，酶解2.5h，升溫至85℃滅酶15min，加入75%乙醇加熱回流3h。抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮。

1.2.3 黃酮提取率的測定

加入75%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL 的容量瓶中定容，充分搖勻備用[7]。分別從各組單因素試驗得到的樣品溶液中移取1mL，加2mL 的10%硝酸鋁，再加75%乙醇定容至25mL，并以75%乙醇為參比液，于510nm 處測定吸光度[7]。

2 結(jié)果分析

2.1 酶種類對提取結(jié)果的影響

固定料液比1:25、酶解時間2.5h、酶解溫度50℃、回流時間3h 的條件下，考察毛竹葉中黃酮在纖維素酶、果膠酶、纖維素酶和果膠酶混合酶的不同條件下對提取率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶種類對黃酮吸光值的影響

由圖1 可知：使用果膠酶或者纖維素酶和果膠酶混合酶提取時，提取率不及使用纖維素酶的效果好，因為纖維素酶可改善植物細胞壁的通透性，使得細胞壁內(nèi)的活性成分大量涌出[8]。因此在使用有機溶劑回流提取的前提下，使用纖維素酶輔助提取率更高。

2.2 料液比對提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、酶解時間2.5h、酶解溫度50℃、回流時間3h 的條件下，考察在料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的不同條件下對竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 料液比對黃酮吸光值的影響

由圖2 可知：料液比的值越大，其提取率越高，說明料液比對毛竹葉中黃酮的提取率影響明顯。在料液比為1∶25（g/mL）時提取率達到了峰值，1∶25 后提取率又開始降低。因此，最佳料液比為1∶25。

2.3 酶解時間對提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解溫度50℃、回流時間3h 的條件下，考察在酶解時間為1h、1.5h、2h、2.5h、3h 的不同條件下對毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酶解時間對黃酮吸光值的影響

由圖3 可知：毛竹葉中黃酮提取率在隨著酶解時間的延長而升高，說明酶解時間對其提取率的影響比較明顯。在酶解時間為2.5h 時提取率達到了峰值，之后提取率開始降低。隨著酶解預處理時間的增加，溶劑與底物之間接觸時間更長，纖維素酶可以使毛竹葉細胞壁纖維被降解，從而使毛竹葉中黃酮更多的釋放出來[9-11]，但達到峰值后，接觸面積不再增大。因此，最佳酶解時間為2.5h。

2.4 酶解溫度對提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解時間2.5h、回流時間3h 的條件下，考察在酶解溫度為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的不同條件下對毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 酶解溫度對黃酮吸光值的影響

由圖4 可知：酶解溫度越高，一定范圍內(nèi)其提取率升高。在酶解溫度為50℃時提取率最大，之后提取率開始降低。隨著酶解溫度的升高，纖維素酶的酶活性開始降低，甚至失活[8]。因此，最佳酶解溫度為50℃。

2.5 回流時間對提取結(jié)果的影響

固定纖維素酶0.08g、料液比1∶25、酶解時間2.5h、酶解溫度50℃的條件下，考察在回流時間為1h、2h、3h、4h、5h 的不同條件時對毛竹葉中黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 回流時間對黃酮吸光值的影響

由圖5 可知：回流時間越長，其提取率越高，回流時間對毛竹葉中黃酮的提取影響較明顯。在回流時間為3h 時提取率最大，之后提取率不但沒有升高反而略有下降。因此，最佳回流時間為3h。

3 討論

分析纖維素酶法輔助提取毛竹葉中黃酮的單因素實驗結(jié)果可得：不同的提取條件對提取率的影響較為明顯。為保證提取結(jié)果最佳，提取條件可設置為：纖維素酶0.2%、料液比1∶25、酶解時間2.5h、酶解溫度50℃、回流時間3h。

通過文獻可知，研究人員大多單方面選擇有機溶劑熱回流法，或者纖維素酶法進行提取，將二者合理結(jié)合實驗后可知，采用了纖維素酶預處理的實驗組，其提取率明顯高于其中任一組。因此采用纖維素酶輔助熱回流法對毛竹葉中黃酮的提取進行了研究，可為后續(xù)采用純酶提取毛竹葉中黃酮的研究提供一定的理論依據(jù)。

實驗過程中需要注意的是，加入酶時要保證竹葉粉和蒸餾水混合物的溫度應達到最適合的酶解溫度50℃，避免溫度對酶活性產(chǎn)生影響從而降低黃酮的提取率。