β－煙酰胺單核苷酸對衰老小鼠的抗氧化作用研究

王思蓉,王言之,李世芬,3,王光路,張靜姝,3△

(1.南京醫科大學公共衛生學院，江蘇 南京，211166；2.南京醫科大學第一臨床醫學院，江蘇 南京，211166；3.江蘇省醫藥農藥獸藥安全性評價與研究中心，江蘇南京，211166；4.石家莊以嶺藥業股份有限公司，河北石家莊，050035)

β－煙酰胺單核苷酸(NMN)，是哺乳動物體內一種關鍵性輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前體物質，其主要功能由NAD+體現[1]，參與許多關鍵過程，包括能量代謝，基因表達和DNA 修復。β－煙酰胺單核苷酸是人體內的固有物質，同時也可從如牛油果、西蘭花等[2]蔬菜水果中獲取，檢測發現其含量在毛豆、牛油果中尤多[3]。David Sinclair 于2019年發表的《lifespan》書中介紹了關于β－煙酰胺單核苷酸的研究，引發免疫學界、營養學界的廣泛關注，但目前對β－煙酰胺單核苷酸的作用及相關機制的研究仍然存在大量空白。根據現有報告，β－煙酰胺單核苷酸對退行性疾病（如阿茲海默癥[4]、帕金森疾病[5]）具有一定的治療意義。補充一定劑量的NMN能增加NAD+的含量，可促進神經血管再生，起到線粒體保護、抗炎抗凋亡的作用[6]。對于某些罕見疾病如Leigh 綜合征，給予NMN 能延長患該病小鼠壽命并緩解有關癥狀[7]。為探究β－煙酰胺單核苷酸更多的作用價值，現將β－煙酰胺單核苷酸作為受試物，分高、中、低3 個劑量組對小鼠灌胃并測量MDA、SOD、GSH 的指標含量，擬對β－煙酰胺單核苷酸對衰老小鼠的抗氧化作用進行評價，為相應的臨床應用和產品研發提供實驗數據支持。

1 材料和方法

1.1 配方篩選

抗氧化系列項目配方篩選，配方為單一NMN成分，設定人體推薦攝入量為250、125、60mg/人/日（60kg），按這3 個配方組合設計動物實驗，NMN 由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。

1.2 實驗動物及飼養環境

選用上海西普爾-必凱實驗動物有限公司繁殖的SPF 級ICR 健康8 月齡雄性小鼠50 只，飼養于南京醫科大學衛生分析檢測中心屏障系統，溫度20～25℃,相對濕度40%～70%，生產許可證號SCXK（蘇）2018-0006，合格證編號：20180006013099。

1.3 試驗方法

以上3 種配方，均按人體推薦劑量的10 倍作為動物實驗灌胃劑量，將200mg/人/日VC 劑量組作為陽性對照組，各劑量組用無菌水配制；同時設溶劑對照組，給與無菌水。小鼠適應環境至少3d，按血清中MDA 水平分為5 組，每組10 只。各劑量組小鼠給予不同受試樣品按0.1mL/10g 體重進行灌胃，1次/d，連續30d。實驗結束時取血測血清中脂質氧化產物含量，取肝測肝組織中蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量及抗氧化酶活力。

2 結果

2.1 對小鼠一般情況的影響

小鼠灌胃前后體重見表1，數據處理知，各劑量組與溶劑對照組相比，各周體重均無統計學差異（P＞0.05），反映NMN 對小鼠體重無明顯影響。

表1 對小鼠各周體重的影響（）

表1 對小鼠各周體重的影響（）

2.2 小鼠血清中MDA 的影響

由表2 可見，除溶劑對照組外，各觀察組實驗后MDA 相對實驗前均存在不同程度的降低，以NMN(125mg/d)、VC(200mg/d)組最為顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 小鼠血清中MDA 的含量（）

表2 小鼠血清中MDA 的含量（）

注：“*”表示與溶劑對照組比較，P＜0.05。

2.3 小鼠肝組織中蛋白質羰基含量

由表3 可見，和溶劑對照組相比，各劑量組小鼠的蛋白質羰基含量均有所減少，其中VC(200mg/d)組的差異有統計學意義（P＜0.05），而NMN(125mg/d)組雖然相對陰性對照組蛋白質羰基含量平均值下降了26.09%，但差異無統計學意義，或與實驗動物數量偏少存在一定聯系。

表3 小鼠肝組織中蛋白質羰基的含量（）

表3 小鼠肝組織中蛋白質羰基的含量（）

注：“*”表示與溶劑對照組比較，P＜0.05。

2.4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力

由表4 可見，各觀察組小鼠肝組織中SOD 均高于陰性對照組，以NMN(250mg/d)組效果最明顯，平均相對增長了72.9(U/mgprot)，NMN(60mg/d)組次之，平均相對增長了49.9(U/mgprot)。NMN(250、125、60mg/d)及VC(200mg/d)組差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力（）

表4 小鼠肝組織中SOD 及GSH-PX 活力（）

注：“*”表示與溶劑對照組比較，P＜0.05。

2.5 小鼠肝組織中GSH 含量

由表5 可見，NMN（125mg/d）組小鼠肝組織中GSH 高于溶劑對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與VC(200mg/d)組比較，NMN（125mg/d）組小鼠肝組織中GSH 含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表5 小鼠肝組織中GSH 含量（）

表5 小鼠肝組織中GSH 含量（）

注：“#”表示與VC(200mg/d)組比較，P＜0.05。

3 結論

參照 《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）之抗氧化功能試驗的結果判定，在本實驗條件下，NMN 對衰老小鼠具有抗氧化作用，且NMN 在125mg/d 的劑量下對衰老小鼠的抗氧化作用明顯優于250mg/d 和60mg/d 劑量組。

4 討論

β－煙酰胺單核苷酸作為輔酶NAD+的前身，其發揮相應的功能作用由NAD+完成。因NAD+分子很難直接進入細胞，故補充NAD+是以服用NAD+前體形式吸收入血液，才能讓其在細胞內得到利用和轉化。Zhang Hongbo 等[8]已證實補充一定劑量的NAD+能改善小鼠的線粒體功能，延長壽命。但NAD+的含量水平以及其氧化還原狀態卻隨年齡的增大而呈下降趨勢[9]，其導致年齡相關的NAD+減少的機制還未被闡明[10]。β－煙酰胺單核苷酸作為NAD+前體在補充NAD+的含量以及增強其相應功能具有重要意義，如口服β－煙酰胺單核苷酸能有效加快合成組織中的NAD+，并緩解小鼠年齡相關的生理衰退[11]。

近年來，針對抗氧化劑的研究方興未艾，而新型抗氧化劑在疾病防控和治療方面的作用受到越來越多的關注。自由基、ROS 及其衍生的氧化應激物對可對機體健康造成危害，如異常衰老及其衰老相關疾病[12]、心血管系統疾病、代謝綜合性疾病等[13]。利用β－煙酰胺單核苷酸的抗氧化作用，清除多余生成的自由基、ROS，降低其對機體組織的損害，已然成為延緩衰老、治療疾病的新的靶向。補充β－煙酰胺單核苷酸從而增加NAD+含量，能有效抑制活性氧的生成、減少線粒體斷裂，為急性腦損傷和神經退行性疾病提供治療思路[14]。Natalie 等[15]指出β－煙酰胺單核苷酸能夠有效逆轉老齡小鼠血管功能和氧化應激，是應對老年心血管疾病的有效干預措施；Wang Tao 等[16]報道NMN 轉移酶3 通過調節NAD+的水平對兔骨髓質充質干細胞具有抗氧化應激的效果，但其抗氧化的相關機制還尚未明確。另外，活性氧是惡性腫瘤的誘因[17]，可引發腫瘤細胞的增殖、提高其耐受性，基于此，深化對β－煙酰胺單核苷酸抗氧化機制的相關研究可以為抑制惡性腫瘤的產生及發展開拓領域[18]。不論作為NAD+前體還是就其本身而言，β－煙酰胺單核苷酸的潛藏價值都值得人們的深入研究和探討評估。