基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究“黃連-知母”治療2 型糖尿病的作用機(jī)制*

侯桃霞，趙小芳，劉愛萍，高 博，李 欽，2△

（1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730300 ；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）已經(jīng)成為巨大的且越來越突出的全球性健康問題，是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病之一。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2017 年全球糖尿病患者總數(shù)達(dá)到4.25 億，比2015 年增加了1000 萬；此外還有約3.5 億糖尿病高危人群，預(yù)計(jì)到2045 年，將會(huì)有近7 億糖尿病患者。我國的患病人數(shù)已達(dá)1.14 億，將近全球患者的1/4[1-2]。而在糖尿病的分類中，又以2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）居多，占患病總?cè)藬?shù)的90%以上。糖尿病已然成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的非傳染性慢性疾病。調(diào)查顯示，糖尿病風(fēng)暴，不僅會(huì)危害公眾健康，還會(huì)衰減生產(chǎn)力，削弱經(jīng)濟(jì)發(fā)展。2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)在的主要手段是控制病情，延遲病情的發(fā)展，尚無有效的方法可徹底治愈。西藥主要采用二甲雙胍、羅格列酮治療效果好，但長時(shí)間用藥會(huì)導(dǎo)致耐藥性增加，且并未能有效控制疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3]。相較之西藥，中藥有多成分、多靶點(diǎn)共同作用的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)造成了中藥作用機(jī)制闡釋上的困難。

糖尿病歸屬于中醫(yī)學(xué)的“脾癉”的范疇，常有“三多一少”的癥狀。而現(xiàn)在2 型糖尿病患者中肥胖占多數(shù)且多無“三多一少”的癥狀[4]，仝小林教授團(tuán)隊(duì)[5]認(rèn)為多因在遺傳背景下多食和少動(dòng)導(dǎo)致的體內(nèi)營養(yǎng)過剩、糖脂代謝紊亂，以“中滿內(nèi)熱”為核心病機(jī)。肥胖或超重患者多有過食肥甘或飲食不節(jié)的病史，過食傷胃，胃氣受損，失于和降，造成食郁中焦。食郁阻滯氣機(jī)，樞機(jī)不利，郁熱內(nèi)生。故將黃連應(yīng)用于糖尿病郁熱虛損各個(gè)階段。黃連苦寒，能燥泄胃腸之濕熱，又可清瀉心胃之實(shí)火，有降糖、降壓、解毒等功效[6]。知母苦寒，入胃經(jīng)可涼胃熱，瀉火存陰，為苦潤清熱滋陰要藥，可用于高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘等[7]。二藥配伍，清熱兼顧滋陰生津，可用于治療邪熱傷陰導(dǎo)致的2 型糖尿病[8]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)“黃連-知母”藥對(duì)治療2 型糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為“黃連-知母”的進(jìn)一步研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 軟件及數(shù)據(jù)庫

1.1 軟件

Cytoscape 軟件（V 3.8.1）。

1.2 數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP V 2.3）；PubChem 數(shù)據(jù)庫；Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫；GeneCards 數(shù)據(jù)庫；Venny 在線平臺(tái)（V 2.1.0）；STRING 數(shù)據(jù)庫（V 11.0）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（V 6.8）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 活性成分的獲取及篩選

在TCMSP 平臺(tái)分別以“黃連”“知母”為關(guān)鍵詞檢索，檢索到的結(jié)果以口服生物利用度OB%≥30%、類藥性DL≥0.18 為條件[9]進(jìn)行篩選，得到的成分作為“黃連-知母”藥對(duì)的成分。

2.2 靶點(diǎn)的獲取及篩選

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索活性成分SMILES式，將SMILES 式導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，以Probability＞0 作為篩選條件，符合條件的靶點(diǎn)作為成分-靶點(diǎn)。

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，以“Type 2 Diabetes”為關(guān)鍵詞檢索，將檢索到的靶點(diǎn)作為疾病-靶點(diǎn)。

將成分-靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到的靶點(diǎn)作為共有靶點(diǎn)。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，繪制共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2.3 GO 分析及KEGG 通路分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 活性成分篩選結(jié)果

共檢索到“黃連”成分48 個(gè)，篩選后得到14 個(gè)成分；“知母”成分81 個(gè)，篩選后得到16 個(gè)成分。共得到“黃連-知母”藥對(duì)成分30 個(gè)，成分及其歸屬見表1。

表1 “黃連-知母”藥對(duì)成分及歸屬

3.2 靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

檢索共得到靶點(diǎn)1839 個(gè)，其中黃連相關(guān)靶點(diǎn)416 個(gè)，知母相關(guān)靶點(diǎn)265 個(gè)，檢索到的靶點(diǎn)合并去重后共有491 個(gè)靶點(diǎn)，成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，共有24 個(gè)成分參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（另外6 個(gè)成分無預(yù)測(cè)結(jié)果，故舍去）。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫共檢索到2 型糖尿病疾病相關(guān)靶點(diǎn)13131 個(gè)。

圖1 成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖

采用Venny 在線平臺(tái)將二者映射，共得到459個(gè)靶點(diǎn)，韋恩圖如圖2 所示。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，選取物種為“Homo sapiens”，輸出置信度在0.700 以上的結(jié)果，如圖3 所示。圖3 中435 個(gè)靶點(diǎn)

圖2 成分-靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)映射韋恩圖

圖3 共有靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 GO 分析結(jié)果

共有靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 分析，導(dǎo)出GO 分析中的生物過程（Biological Process,BP）富集分析結(jié)果。以P-Value＜0.01 為條件，發(fā)現(xiàn)“黃連-知母” 治療2 型糖尿病的過程主要富集在460 條生物過程。將得到的生物過程按照相關(guān)基因產(chǎn)生3558 條關(guān)系（有24 個(gè)靶點(diǎn)未參與網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建），平均節(jié)點(diǎn)度為15.5，P-Value＜10-16，說明該網(wǎng)絡(luò)有意義。數(shù)由大到小排列，輸出前20 條結(jié)果，見表2。將前20 條結(jié)果以氣泡圖形式展現(xiàn)如圖4 所示。主要有蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等生物過程。

圖4 GO 分析生物過程結(jié)果氣泡圖（前20 條）

表2 GO 生物過程分析結(jié)果（前20 條）

3.4 KEGG 通路分析結(jié)果

共有靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路分析，對(duì)P-Value＜0.01 的結(jié)果進(jìn)行分析，按照相關(guān)基因數(shù)由大到小排列，輸出前20 條結(jié)果，見表3。將前20 條結(jié)果以氣泡圖形式展現(xiàn)如圖5所示。主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路等通路。

圖5 KEGG 通路分析結(jié)果氣泡圖（前20 條）

表3 KEGG 通路分析（前20 條）

4 討論

在篩選中藥成分靶點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃連、知母二藥有190 個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)，占成分靶點(diǎn)總數(shù)的38.70%，提示二藥有很強(qiáng)協(xié)同作用，體現(xiàn)在二藥可共同作用于大量相同靶點(diǎn)，功能上可有一定的疊加作用[10]。采用Cytoscape 軟件進(jìn)行多層次分析，將“中藥-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”繪制成可視化圖，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 中藥-成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路可視化網(wǎng)絡(luò)圖

由圖6 可知，黃連、知母雖然在成分上沒有交叉，但二者包含的多種成分作用靶點(diǎn)重合，且多種靶點(diǎn)作用于同一信號(hào)通路，這可用于解釋黃連、知母相使為用的科學(xué)內(nèi)涵。這也為中藥配伍“七情”的進(jìn)一步研究提供新的研究思路。

以PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）為例，通路圖如圖7 所示。“黃連-知母”成分可同時(shí)作用于PI3K-Akt 信號(hào)通路上游、中游、下游多個(gè)靶點(diǎn)，且可以通過PI3K-Akt 信號(hào)通路作用于MAPK 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。這為中藥多成分、多靶點(diǎn)、作用機(jī)制復(fù)雜提供又一理論依據(jù)。如圖7 所示。

圖7 PI3K-Akt 信號(hào)通路圖

在對(duì)KEGG 富集分析的過程中，重點(diǎn)對(duì)信號(hào)通路的結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。此外，在對(duì)疾病的富集結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)直接富集到“2 型糖尿病（hsa04930:Type II diabetes mellitus）”的結(jié)果（p-Value=5.72×10-9），相關(guān)基因有17 個(gè)（PRKCE、INSR、PIK3CD、PIK3CB、PIK3R1、TNF、PRKCZ、MTOR、PIK3CG、GCK、MAPK10、IKBKB、MAPK9、MAPK8、PIK3CA、MAPK1、MAPK3）；在對(duì)生物過程的富集結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)直接富集到“胰島素抵抗（hsa04931:Insulin resistance）”的結(jié)果（p-Value=9.06×10-9），相關(guān)基因有25 個(gè)（GSK3B、PIK3CD、PYGL、PIK3CB、PIK3R1、TNF、PRKCZ、PIK3CG、IKBKB、MAPK9、RPS6KA3、MAPK8、AKT2、RPS6KA1、AKT1、PTPN1、CPT1A、PRKCE、INSR、STAT3、MTOR、PPP1CA、MAPK10、PIK3CA、RPS6KB1）。從疾病、生物過程的富集結(jié)果可說明“黃連-知母”可調(diào)節(jié)胰島素抵抗作用從而達(dá)到治療2 型糖尿病的作用。這與2 型糖尿病的治療原則相一致，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果可信度較高，對(duì)“黃連-知母”的進(jìn)一步研究有一定的指導(dǎo)作用。