植物乳桿菌MG-1半固態發酵豇豆工藝響應面優化研究

張天天，鄧后勤，黃嬌麗，朱樹清，龐 立，易有金，夏 菠

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.汝城縣繁華食品有限公司，湖南 郴州424100；3.湖南農業大學 園藝學院，湖南 長沙410128）

豇豆是中國的大宗蔬菜，含有豐富的維生素、蛋白質及微量元素，具有益氣健脾、開胃和中等功效，被譽為“蔬菜中的肉類”[1]。其營養價值高、質脆味美，深受大眾喜愛[2-3]。

由于豇豆采收后不易貯藏、易萎蔫、褪色和腐爛，所以新鮮豇豆采摘后要及時進行處理[4]。人們通過不同的加工方法對豇豆進行加工和利用，腌漬發酵豇豆因耐貯藏、口味獨特而深受大眾喜歡[5-7]。但在制作過程中方法不當也會引起一些食品安全問題，如食鹽含量過高及亞硝酸鹽含量超標等[8-10]。因此，對其發酵方法進行研究，掌握豇豆發酵過程的主要工藝參數及品質變化規律、降低食鹽使用量和亞硝酸鹽含量，提高豇豆食品的安全性和營養價值具有重要的意義。

以發酵后豇豆的總酸含量、亞硝酸鹽含量、維C含量進行加權，綜合加權指標X=0.3×總酸含量+0.3×維C含量+0.4×（1/亞硝酸鹽含量），以自然發酵做對照，通過響應面曲線對豇豆發酵加工工藝的關鍵參數進行了優化。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

豇豆，購于湖南農業大學東芝源超市，以無損傷、無腐爛或發霉，新鮮為標準，采收后立即運回實驗室進行試驗；食鹽，購自湖南農業大學東芝源超市；植物乳桿菌MG-1（Lactobacillus plantarum），湖南農業大學食品科學技術學院微生物實驗室分離保存，GenBank（MG766279）；氫氧化鈉、乙酸鋅、冰醋酸、鹽酸、亞鐵氰化鉀、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

DK-S48型水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產品；WFJ7200型可見光分光光度計，尤尼柯儀器有限公司產品；ZWFR-2112型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海智城分析儀器有限公司產品；LRH-250型智能生化培養箱，上海飛躍實驗儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理所用器具都用0.1%次氯酸鈉進行消毒處理。試驗原料選擇新鮮脆嫩，無腐爛、無發霉的豇豆，清洗豇豆表面的泥沙、污物洗凈、晾干；切成2～3 cm的段，且每份樣品稱取100 g，根據響應面曲線設計的試驗，按照不同的植物乳桿菌MG-1接種量、食鹽質量分數、水分含量、發酵溫度及發酵時間處理豇豆。發酵完成后，測定其總酸含量、亞硝酸鹽含量、維C含量并進行綜合加權。

1.3.2 響應曲面設計

以Box-behnken法為根據，按照發酵溫度、發酵時間、接種量、水分含量及食鹽質量分數為自變量，綜合亞硝酸鹽含量、維C含量和總酸含量作為加權指標，設計五因素三水平響應曲面，優化豇豆植物乳桿菌MG-1發酵工藝，確定最優組合。

響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.3.3 指標的測定

（1）總酸含量的測定。按照國標GB/T 12408—2008進行測定[11]，樣品中總酸（以乳酸量計）含量。

（2）亞硝酸鹽含量的測定方法。按照國標GB 5009.33—2016進行測定[12]。

（3）維C含量的測定。按照GB 5009.86—2016食品中抗壞血酸的測定方法，采用2,6-二氯靛酚滴定法測定[13]。

綜合指標X=0.3×總酸含量+0.3×維C含量+0.4×（1/亞硝酸鹽含量）。綜合指標值越大代表植物乳桿菌MG-1純種半固態發酵發酵豇豆效果越好。

2 結果與分析

2.1 響應面優化試驗結果

以不同植物乳桿菌MG-1接種量、食鹽質量分數、水分含量、發酵溫度及發酵時間處理豇豆，以亞硝酸鹽含量、總酸含量、維C含量為加權綜合指標，確定了5個因素對豇豆發酵效果的影響。試驗共有46組，其中有析因點40個，6個零點為中心重復試驗，估計誤差。

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果

2.2 響應面試驗結果分析

采用多元回歸分析處理響應面試驗結果，結果如表3所示。非線性回歸的二次多項式擬合后，得到如下回歸模型方程：

回歸方程系數顯著性檢驗見表3。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗

由統計數據可知，該響應面回歸模型具有顯著性（p＜0.000 1），失擬項的F值不顯著（p＞0.05），表明模型與試驗預測結果擬合性較好。方程一次項中，食鹽質量分數（A）、接種量（B）、發酵時間（E）因素對響應值（豇豆發酵指標）的影響極顯著（p＜0.01），方程一次項中，發酵溫度因素對豇豆發酵指標的影響顯著（p＜0.05）。各因素對指標影響順序為發酵時間、食鹽質量分數、接種量、發酵溫度及水分含量。二次項因素均具有顯著性（p＜0.01），表明具有顯著的曲線關系。

2.3 試驗因素相互作用分析

在各試驗因素之間，食鹽質量分數和發酵時間、接種量和水分含量、接種量和發酵時間、水分含量和發酵溫度、水分含量和發酵時間、發酵溫度和發酵時間的交互作用對豇豆發酵效果影響均不明顯（p＞0.05）。但接種量和發酵溫度之間的相互作用效果明顯（p＜0.05）。

接種量取恒定值時，響應面綜合指標隨著發酵溫度降低先增加后降低，31℃時獲得最大值；若固定發酵溫度，響應面綜合指標隨著接種量的降低先增加后下降，接種量為5%獲得最大值。兩因素相互作用等高線趨于橢圓形（p＜0.05），說明該相互作用對發酵結果有較大影響。而從等高線的疏密程度可以判斷，在該交互作用中，接種量對發酵結果的影響較發酵溫度要大。

接種量和發酵溫度對響應面指標的影響見圖1。

圖1 接種量和發酵溫度對響應面指標的影響

2.4 驗證試驗

根據對豇豆純種發酵指標的二次多項方程求解，得到最佳發酵組合為發酵溫度31.09℃，接種量5.10%，食鹽質量分數5.59%，水分含量85.56%，發酵時間6.6 d，在此條件下得到的加權綜合發酵指標為0.976 6。因此，結合實際情況，確定發酵條件為接種量5%，溫度31℃，水分含量85%，食鹽質量分數6%，發酵時間7 d，重復3次試驗。

接種發酵與自然發酵對豇豆亞硝酸鹽、總酸、維C含量、硬度、色差的影響見表4。

由表4可知，接種發酵的亞硝酸鹽含量和色差明顯明顯低于自然發酵；總酸含量、維C含量和硬度均高于自然發酵的結果。因此，植物乳桿菌MG-1純種半固態發酵豇豆不僅可以保持豇豆良好的脆度和口感，也減少了豇豆營養價值的流失。

3 結論

通過響應面試驗，以亞硝酸鹽含量、總酸含量、維C含量為加權綜合指標，確定了獲得最佳豇豆發酵工藝條件。在該條件下制備發酵豇豆可以獲得較之前更好的效果，為豇豆高值化利用和附加產品提供了新思路。豇豆發酵加工由自然發酵逐漸向純種發酵轉變。接種發酵的優勢菌在發酵過程中起主導菌群的作用[14]。研究的植物乳桿菌MG-1純種半固態發酵豇豆。結果表明，該種發酵方式不僅可以人為控制自然發酵的諸多不足，所用菌種快速成為優勢菌，能夠加快發酵速度、減少營養成分損失、保持脆度、降低亞硝酸鹽含量，而且還可進一步運用于發酵蔬菜低鹽工藝中。