基于蘋果多酚的NFC蘋果汁鑒偽方法的建立

劉 靚，雷佳蕾，梁佳蕊，鄧 紅，2，3，孟永宏，2，3，郭玉蓉，2，3

（1.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西西安710062；2.國家蘋果加工技術研發專業中心，陜西西安710119；3.西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西西安710119）

0 引言

中國是蘋果栽培大國，種植面積與產量均居世界第一，2019僅陜西省蘋果產量達到1 135.58萬t，種植面積62萬hm2。除用作鮮食外，大量的外形欠佳、品質良好蘋果被加工為果汁[1-2]。而全球每年消耗超過1 600萬t的果汁中蘋果汁占有重要的市場份額。近年來，隨著消費者的健康意識不斷提高，NFC（Not form concentrate，非濃縮還原汁）蘋果汁的銷量日益增高。正是NFC果汁高昂的售價和廣闊的市場背景，使它成為摻假的目標[3-4]。因此，NFC果汁的真實性一直是政府機構與消費者關注的問題；為了確保公平的市場競爭和消費者利益并促進國際貿易，急需開發能夠檢測NFC果汁真實性的技術，并在生產實踐與產品銷售中加以利用。

NFC（Not form concentrate，非濃縮汁）果汁產品摻假主要是用FC（Form concentrate，濃縮汁）加水復原代替NFC蘋果汁或是在NFC蘋果汁中摻入部分FC果汁進行銷售，但FC與NFC果汁的化學成分差異不大，傳統的物理和化學分析方法難易區分FC與NFC，目前主要是利用穩定同位素技術[5-6]進行鑒偽；這種方法已經獲得了美國分析化學師協會（AOAC）及歐盟標準化委員會（ComitéEuropéen de Normalisation，法文縮寫：CEN）的認可（如標準ENV 12141和ENV 12142）。雷佳蕾等人[7]利用IRMS（Isotope ratio mass spectrometry，同位素比率質譜法）分析測定了16個不同品種的蘋果NFC與FC果汁的δD、δ18O值，得出相似的結果；但IRMS[8-9]的定量分析還不盡人意。

陜西蘋果產量居中國第一，蘋果是帶動陜西經濟發展的重要支柱產業。蘋果中的多酚種類、含量與蘋果品種、原產地、種植條件、成熟期、生態環境等因素密切相關，中外學者對蘋果多酚的研究非常多且方法比較成熟[10-13]，尤其是不同品種的蘋果，所含有的蘋果多酚類物質的種類及含量都不相同，不同品種蘋果間多酚的差異也是抗氧化能力不同的根本原因。

目前，對不同品種蘋果多酚的研究尚不多見，冉軍艦等人[14]在13種蘋果中均檢測出10種單體酚，鞣花酸、綠原酸、表兒茶素的含量相對較高，兒茶素、咖啡酸、原兒茶酸的含量相對較低。李鑫[15]以35個品種蘋果（Malus pumila Mill.）果實為材料，研究總酚、總原花青素等指標，證實不同品種間總酚含量差異顯著。Urska Vrhovsek等人[16]研究了意大利、委內瑞拉等西方國家的41個蘋果品種中的多酚物質，發現不同品種蘋果總多酚的平均含量在66.2～211.9 mg/100 g，主要類別是黃烷醇，其次是羥基肉桂酸、黃酮醇、二氫查耳酮和紅蘋果花青素。

探討不同品種蘋果汁NFC與FC中多酚種類含量差異的研究尚是空白，試驗通過提取和分析研究不同品種蘋果的NFC與FC果汁中的多酚類物質的種類和含量的差異，用于蘋果（NFC）果汁的真偽的鑒別，試驗結果為蘋果（NFC）果汁的質量監控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蘋果原料品種10個（自由、延光、橘蘋、富士、寒福、黛綠、嘎啦、首紅、喬納金、元帥）采于西北農林科技大學白水蘋果試驗站，并于4℃下冷藏保存；多酚標準品（沒食子酸，綠原酸，咖啡酸，4-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮素11種標準品），Sigma公司提供；試劑（無水乙醇、異丙醇、氯仿、瓊脂糖、乙酸乙酯、冰醋酸等均為分析純試劑，甲醇為色譜純試劑），西安市森博玻璃儀器采供站提供。

1260 Infinity型安捷倫高效液相色譜儀，上海安捷倫科技公司產品；C18型液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），上海安捷倫科技公司產品。

1.2 試驗分析方法

1.2.1 NFC、FC、AAJ蘋果汁的制備

NFC、FC蘋果汁的制備參照文獻[2]方法進行，摻假果汁（Adulterated apple juice，AAJ）蘋果汁的制備參見文獻[9]。

1.2.2 不同品種NFC、FC蘋果汁中多酚的分析

（1）單體酚標準溶液的制備。參照文獻[11]分別稱取0.1 mg沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮素、根皮苷等標準品，分別溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混勻，放置于冰箱中，于4℃下避光保存備用，待色譜分析。根據單體酚標準品的保留時間判斷混合標準品HPLC色譜圖中各個峰所代表的多酚物質。

（2）混合標品標準溶液的制備。參照文獻[11，17]分別稱取沒食子酸0.1 mg、綠原酸0.6 mg、咖啡酸0.6 mg、4-羥基苯甲酸0.2 mg、兒茶素0.6 mg、表兒茶素0.6 mg、蘆丁0.8 mg、槲皮苷0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素標準品0.5 mg，溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混勻。分別從以上每個單體酚標準溶液中取出1 mL混合均勻，于4℃下避光保存備用，待色譜分析；用于制作混合標準品HPLC色譜圖。

（3）蘋果多酚的HPLC法測定色譜條件的確定。參照文獻[17]，選擇色譜柱為Welchrom C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，紫外檢測波長為280 nm，進樣量20 μL；流速1 mL/min，柱溫30℃；流動相A相0.3%的冰乙酸，流動相B相100%的甲醇（色譜純）。

（4）梯度洗脫程序參照文獻[18]確定。以100%的甲醇和0.3%的冰醋酸為流動相通過調整梯度洗脫程序及單體酚標準品的質量濃度以達到分離混合標準品中多酚物質的目的，使混合標準品中的各個單體酚標準品的保留時間相差較大，高效液相參照1.2.2（2）的方法制作標準曲線。參照文獻[17-18]分別稱取沒食子酸0.1 mg、綠原酸6 mg、咖啡酸0.6 mg、對羥基苯甲酸0.2 mg、兒茶素0.6 mg、表兒茶素0.6 mg、蘆丁0.8 mg、槲皮素0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素標準品0.5 mg，分別溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中，混和均勻[12]。分別從以上每種單體酚標準溶液中取出1 mL混合均勻，得到混合標準品。按照混合標準品與70%的甲醇體積為0.1∶1.9，0.2∶1.8，0.4∶1.6，0.8∶1.2，1.2∶0.8，1.6∶0.4，2.0∶0的方法取出混合標準品和甲醇混合均勻，制作7個不同質量濃度的混合標準品[15-17]。從7個不同質量濃度的混合標準品中每個取出1 mL通過0.45 μm的微孔濾膜過濾置于棕色樣品瓶中，于4℃下避光保存，待色譜分析。根據每種單體酚標準品的質量濃度及相對應的峰面積得到其標準品的標準曲線。

式中：C1——1.2.2中所制得混合標準品中某標準品的質量濃度，μg/mL；

V——取出的混合標準品體積，mL；

M——稱取的對應單體酚標準品質量，μg；

C2——NFC果汁中單體酚質量濃度，μg/mL；

C——根據樣品多酚峰面積及相對應標準曲線所得樣品質量濃度，μg/mL。

（4）蘋果NFC果汁中多酚物質的提取溶劑的選擇。參照文獻[17-18]，分別用甲醇、乙酸乙酯、乙醇60 mL與蘋果清汁20 mL按照3∶1的比例混合后置于錐形瓶中，于溫度50℃，功率360 W的情況下超聲輔助提取40 min，用離心機以轉速5 000 r/min離心15 min，取上清液用真空旋轉蒸發儀在40℃的條件下進行旋蒸至干，用氮吹儀進行氮吹后，用100%的甲醇進行復溶，最后定容至5 mL的棕色容量瓶中。取出1 mL通過0.45 μm的微孔濾膜過濾，收集到棕色的樣品瓶中，待液相色譜進樣分析。根據HPLC圖譜峰面積及所得到的標準曲線計算樣品中各種單體酚的質量濃度，通過比較樣品中各種單體酚物質的含量選擇最優的提取溶劑為甲醇。

（6）方法學驗證。精密度、穩定性、加標回收率參照文獻進行，所有峰相對保留時間的RSD均在1%以內，相對峰面積的RSD均在3%以內，說明儀器精密度、穩定性良好，該方法可行。各組分的加標回收率計算如公式（3）。

式中：M1——實測值，將所測得單體酚的峰面積帶入對應1.2.2方法所得的標準曲線得到NFC果汁濃度，乘以體積20 mL得到樣品中多酚實際含量，mg；

M2——樣品中原本所含質量，根據1.2.2方法所得樣品未加入標準品之前中原本所含有的各種單體酚的質量，mg；

M3——添加量，向20 mL樣品中加入的單體酚質量，mg；

Y——加標回收率，%。

1.3 數據統計分析

所有分析進行3次平行試驗。使用Origin 8.0和SPSS 12.0軟件進行數據分析，結果表示為平均值±標準偏差（SD），p＜0.05被認為是影響顯著。主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）被用作評估每個數據集以檢測潛在異常值的探索性技術。

2 結果與分析

2.1 不同品種蘋果汁多酚的分析結果

2.1.1 混和標準品HPLC圖譜與標準曲線的制備

按照1.2.2（3）方法進行試驗，根據HPLC圖譜里出峰的情況不斷調整洗脫程序，得到分離度較好的混合標準品圖譜，確定最終的洗脫程序方法，通過HPLC檢測得到11種單體酚標準品混合物的HPLC圖。

對83例胃癌患者的性別，腫瘤的位置、直徑、Borrmann分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移，以及新輔助化療和 CTC陽性等指標，進行COX單因素和多因素回歸分析。結果發現，胃癌患者術后生存的獨立影響因素為腫瘤分化程度、新輔助化療和 CTC陽性這3項指標（P值分別為0.035、0.011和＜0.001，表2和表3）。

多酚洗脫程序見表1，11種多酚混合標準品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 11種多酚混合標準品的高效液相色譜圖

表1 多酚洗脫程序

根據11種單體酚標準品的保留時間判斷混合標準品中各個色譜峰所對應的單體酚種類，HPLC圖峰依次為沒食子酸-保留時間為8.859 min，4-羥基苯甲酸-保留時間為23.898 min，綠原酸-保留時間為29.326 min，咖啡酸-保留時間為33.998 min，兒茶素-保留時間為38.383 min，表兒茶素-保留時間為44.854 min，蘆丁-保留時間為68.660 min，槲皮素-保留時間為69.390 min，槲皮苷-保留時間為73.722 min，根皮苷-保留時間為78.896 min，根皮素-保留時間為80.743 min。

根據1.2.2（4）采用外標法對分別對選取的11種多酚標準品進行線性回歸分析。準確取混合標準品0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，用70%甲醇添至2 mL，通過0.45 μm的濾膜過濾，進行高效液相色譜法檢測，最后利用質量濃度和峰面積建立線性回歸方程。

單體酚標準品線性回歸方程見表2。

表2 單體酚標準品線性回歸方程

2.1.2 10個品種的蘋果NFC與FC果汁樣品中多酚的種類與質量濃度

根據1.2.2（5）方法可以得到樣品色譜圖中所含有多酚的種類，再根據樣品中多酚的峰面積和標準曲線，對10個品種的蘋果NFC與FC果汁樣品的數據進行處理分析，得到所有樣品中多酚的質量濃度與種類，結果以平均值±標準偏差表示。

10個品種的蘋果NFC果汁樣品中多酚的種類與質量濃度見表3，10個品種的NFC蘋果汁（a）與FC蘋果汁（b）的高效液相色譜圖見圖3，10個品種的蘋果FC果汁樣品中多酚的種類與質量濃度見表4。

由表3可知，10個品種的蘋果NFC果汁樣品都含有4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、槲皮素這5種多酚物質，且在質量濃度上具有顯著性差異；其中綠原酸在10個品種的蘋果NFC果汁樣品中含量最多；試驗所有樣品中不含有兩種多酚物質即根皮苷、根皮素。

表3 10個品種的蘋果NFC果汁樣品中多酚的種類與質量濃度/μg·mL-1

由表4可知，與相同品種NFC蘋果汁相比較，FC蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少，在寒富品種FC果汁中出現了根皮素，在喬納金、自由、延光、富士品種的FC的蘋果汁中出現了根皮素和根皮苷2種酚類。

表4 10個品種的蘋果FC果汁樣品中多酚的種類與質量濃度/μg·mL-1

NFC蘋果汁的多酚種類和含量明顯多于FC蘋果汁，綠原酸在10個品種的蘋果NFC果汁樣品中都是含量最高，沒食子酸在10個品種NFC果汁樣品中出現（在紅富士蘋果NFC果汁中質量濃度最高，在黛綠蘋果NFC果汁中含量最低），兒茶素僅在華碩、延光、首紅、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現（含量最高是元帥蘋果），蘆丁在富士、首紅、喬納金、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現（含量最高是元帥蘋果），槲皮苷僅在延光、富士、寒富、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現（含量最高是延光蘋果）；對羥基苯甲酸、咖啡酸、槲皮素分別在橘蘋、首紅、延光蘋果NFC果汁中含量最高。

FC蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少，但喬娜金蘋果FC蘋果汁中還含有10種多酚物質，黛綠品種的FC果汁中綠原酸相比于NFC果汁來說并未損失，這一點直觀地體現在圖3（a）和圖3（b）中。毋庸置疑，不同品種蘋果的NFC中多酚種類與質量濃度存在較大差異，而相同品種NFC和FC果汁中多酚的種類與含量也會產生很大變化，且FC果汁中由于濃縮工藝等加工方式等方面對多酚的影響，使得果汁中一些多酚物質發生降解等反應而出現新的多酚成分[11，13]。因此，如果NFC果汁中出現了根皮素和根皮苷兩種酚類，即可認為是FC果汁摻假。當然，還需要繼續增加蘋果加工品種為20～30種進行NFC、FC蘋果汁中多酚成分分析，就可得到更有說服力的證據。

圖2 10個品種的NFC蘋果汁（a）與FC蘋果汁（b）的高效液相色譜圖

2.2 方法學驗證結果

在精密度試驗中選取綠原酸作為參照物質將其保留時間定為1，選取表兒茶素作為參照物質將其峰面積定為1，計算得出其他物質的相對保留時間及相對峰面積，連續5次進樣每次所得的HPLC圖譜數據（表5）知，多酚物質相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，說明高效液相色譜機的精密度良好。穩定性試驗（表6）得到的結果，也是每種多酚物質相對保留時間穩定性的RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%。穩定性相對保留時間RSD小于1%，說明高效液相色譜機穩定性良好。加標回收率試驗，得到的結果也比較好，加標回收率除綠原酸之外，均在90%以上，說明試驗的提取方法和高效液相檢測方法良好。

試驗方法精密度分析見表5。

表5 試驗方法精密度分析

3 結論

（1）以甲醇為提取劑超聲輔助提取蘋果汁多酚，10個蘋果品種的NFC果汁都含有4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、槲皮素5種多酚物質（含量最高的是綠原酸），且在質量濃度上具有顯著性差異；試驗樣品中不含有根皮苷、根皮素2種多酚物質。

（2）與相同品種NFC蘋果汁相比較，FC蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少。寒富品種的FC果汁中出現了根皮素，在喬納金、自由、延光、富士品種的FC蘋果汁中出現了根皮素和根皮苷2種酚類；該結果可作為辨別NFC果汁摻假的重要依據。該方法可能成為NFC果汁摻假檢驗中追溯蘋果制品種源的有用工具。

試驗方法穩定性分析見表6。

表6 試驗方法穩定性分析