一種小鼠后肢針灸固定裝置的制作與使用

苑功名,劉興星,公一囡,王洋洋,楊靜雯,徐 媛,郭永明

(天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心,天津 301617)

在針灸實驗研究中,小鼠是應用較多的實驗動物,但其體型小,天性活躍,不易抓取和固定,使針灸操作面臨困難,一些實驗采用氣體麻醉、注射麻醉等方法使小鼠處于安靜狀態后再進行針灸操作。盡管這類方式能夠減少掙扎活動對針灸效果的干擾,但麻醉藥物的使用會對小鼠生命活動指標以及針灸感傳效應產生影響,繼而使得針灸機制的研究受到影響。 因此,能夠在小鼠清醒狀態下進行針灸干預是針灸實驗研究者首要解決的問題。 然而在清醒狀態下,如果操作者固定不當常會激惹小鼠,被其咬傷或抓傷;并且小鼠在固定過程中為了掙脫束縛,常常掙扎導致其受傷或死亡,造成樣本脫落,影響實驗的開展。 布制鼠衣固定是針刺實驗中常用的小鼠固定方法之一,本文將介紹一種在布制鼠衣基礎上進行改良的小鼠后肢固定器,可將小鼠較長時間固定且后肢不易脫出,從而提高實驗操作安全性,保證實驗干預效果。 該固定器可方便應用于小鼠后肢部的針刺、電針、艾灸等干預,以及足部注射、尾部取血、尾靜脈注射等操作。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級BALB/c 雄性小鼠,體重18~22 g,7周齡,共42 只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]。 飼養條件:12 h 光照周期,室溫23℃~ 25℃,濕度45% ~50%,可自由攝食飲水,動物飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心[SYXK(津)2020-0005]。 實驗經過天津中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(TCM-LAEC2019062),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

固定器制作:50 mL 離心管、曲別針、剪刀、鋼鋸條、酒精燈、止血鉗、珍珠棉泡沫板、橡皮筋、砂紙;小鼠針刺:規格為0.16 mm×7 mm 的一次性無菌針灸針(北京中研太和醫療器械有限公司);碘伏、75%乙醇、透明膠帶;行為學評價:足底熱痛測試儀(Ugo,37370);曠場實驗設備、高架十字迷宮設備、動物行為分析系統(上海吉量軟件科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠后肢固定器的制作與使用

(1)小鼠后肢固定器的制作

①呼吸孔:用鋼鋸條切掉離心管管底,做成直徑0.5~0.7 cm 的圓孔,供小鼠呼吸。

②管體:沿圖1 虛線,先用鋼鋸條在距離呼吸孔5 cm 處縱向切開,深度1.4 cm,再由管口水平橫切至此處。

圖1 呼吸孔及管體尺寸Figure 1 Size of breathing hole and tube

③后肢固定孔:將曲別針扳直,再參照圖2 尺寸彎折成后肢固定孔的形狀(如圖3),止血鉗夾住曲別針,用酒精燈燒熱曲別針,在管體左右兩側相對應的位置燙出固定孔。

圖2 后肢固定孔尺寸Figure 2 Size of fixing hole of hind limb

圖3 彎折曲別針制作后肢固定孔Figure 3 Bending paper clip to make fixing hole of hind limb

④珍珠棉泡沫墊:用剪刀按照3 cm×3 cm×1 cm的尺寸剪裁即成。

⑤用砂紙磨平因剪切形成的鋒利毛刺,以防固定器對小鼠造成皮膚破損。 小鼠后肢固定器各部分組件如圖4 所示。

圖4 小鼠后肢固定器實物圖Figure 4 Physical picture of the mice hind limb fixator

(2)小鼠后肢固定器的使用

操作時一人即可完成操作。 輕柔抓取小鼠尾部,借助小鼠喜好鉆洞探索的天性,將小鼠輕輕推入固定器管體。 一手拇指擋住小鼠尾部防止退出,另一手從后肢固定孔輕輕掏出小鼠后肢至自然伸展狀態。 用泡沫墊擋在小鼠尾部,并用橡皮筋綁扎泡沫墊固定(如圖5)。 每次實驗結束后,清理糞便并用乙醇噴涂擦拭,祛除異味。

圖5 小鼠后肢固定器的使用Figure 5 Use of the mice hind limb fixator

1.3.2 小鼠的足三里穴位針刺

將小鼠仰臥位固定,選擇雙側足三里穴進行針刺,足三里穴位定位:于小鼠膝關節后外側,腓骨小頭下方約3 mm 處。 碘伏、75%乙醇對穴位局部常規消毒,使用規格為0.16 mm×7 mm 的一次性無菌針灸針,直刺進針,深度約3 mm,注意避開周圍血管和神經,留針時長為30 min。 使用布制鼠衣或小鼠后肢固定器固定針刺如圖6、圖7 所示。

圖6 布制鼠衣固定小鼠針刺Figure 6 Fix and acupuncture with cloth mice clothing

圖7 小鼠后肢固定器固定小鼠針刺Figure 7 Fix and acupuncture with the mice hind limb fixator

1.3.3 小鼠行為學測試

(1)熱輻射痛閾檢測

采用足底熱痛測試儀對小鼠右側足底熱輻射痛閾進行檢測。 以小鼠對紅外熱刺激的最大耐受時間即PWTL(paw withdrawal thermal latency, 熱刺激縮足潛伏期)作為熱輻射痛閾值。 每次測量前將小鼠放入熱輻射痛測試板格中適應30~40 min 直至安靜,每只小鼠每隔5 min 測量1 次,取3 次測量的平均值。 對足底熱輻射痛閾檢測者實施盲法。

(2)曠場實驗

曠場實驗設備由隔音箱(含視頻追蹤攝像頭、白燈、紅外燈)、組件、主控箱、畫面分割器、配套電腦組成。 隔音箱能營造一個相對封閉的穩定環境,減少實驗人員對小鼠行為的干擾。 實驗期間保持安靜,室溫23℃~25℃,濕度50%~60%,實驗前需適應實驗室環境1 h。 實驗時先打開視頻采集攝像頭,再將小鼠頭朝側壁迅速放入底部正中央區域,記錄小鼠的實時運動軌跡。 以小鼠觸碰任意側壁的時刻為起始點,記錄5 min 內的活動軌跡。 每只小鼠完成實驗后,需清理糞便并用乙醇噴涂擦拭,以防異味對后續小鼠造成影響。 實驗結束后導出總路程、平均速度、中央區活動路程、中央區活動時間作為結果指標進行統計分析。

(3)高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗設備由開放臂、閉合臂、視頻追蹤攝像頭、主控箱、配套電腦組成。 開放臂、閉合臂尺寸為65 cm×5 cm,距地面高45 cm。 實驗環境要求同曠場實驗,實驗時先打開視頻追蹤攝像頭,再將小鼠頭朝開放臂迅速放入正中央區域(所有小鼠均朝向同一開放臂放入),以小鼠放入中央區的時刻為起始點,記錄5 min 內的活動軌跡。 每只小鼠完成實驗后,需清理糞便并用乙醇噴涂擦拭,以防異味對后續小鼠造成影響。 實驗結束后導出進入開放臂次數、進入閉合臂次數、開放臂停留時間、閉合臂停留時間,將進入開放臂次數百分比(即進入開放臂次數與進入開放臂、閉合臂總次數之比)、開放臂停留時間百分比(即開放臂停留時間與開放臂、閉合臂停留總時間之比)作為結果指標進行統計分析。

1.4 統計學方法

本研究數據以平均數±標準差(±s)表示,統計學分析采用SPSS 19.0 統計軟件完成。 小鼠固定所需時間、后肢回縮次數、針具脫落次數采用t檢驗比較差異;小鼠體重以及熱輻射痛閾采用重復測量資料的方差分析比較差異;曠場實驗、高架十字迷宮實驗各指標符合正態分布時,采用單因素方差分析,不符合正態分布時,使用非參數檢驗。 以P<0.05 為有統計學差異,以P<0.01 為有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 小鼠后肢固定器與布制鼠衣的固定針刺應用比較

考慮到針刺實驗通常會實施多次干預,因此選取同一批小鼠,將12 只小鼠按隨機數字表法分為布制鼠衣組和小鼠后肢固定器組,每組6 只;為排除單一實驗員操作熟練度對實驗結果的影響,則招募4位實驗員A、B、C、D 參與實驗;為避免同一天實驗會對小鼠造成損傷繼而抗拒固定針刺影響實驗結果,則安排這4 位不同的實驗員分別在第1 天、第3天、第5 天、第7 天使用布制鼠衣或小鼠后肢固定器固定小鼠并針刺,共計4 次。 留針期間4 位實驗員固定小鼠操作時間、小鼠后肢的回縮次數和針具脫落次數(每只小鼠后肢回縮或針具脫落1 次計為1,否則計為0)、每次固定針刺后的體重結果如下。

2.1.1 小鼠固定所需時間的比較

表1 結果顯示,與使用布制鼠衣相比,4 位實驗員使用小鼠后肢固定器固定1 只小鼠的平均用時均更短(P<0.01)。 表明使用小鼠后肢固定器能顯著提高小鼠固定操作的效率。

表1 各實驗員固定1 只小鼠的平均用時(±s,n=6)Table 1 Average time of each experimenter to fix a mouse

表1 各實驗員固定1 只小鼠的平均用時(±s,n=6)Table 1 Average time of each experimenter to fix a mouse

注:與布制鼠衣組比較,??P<0.01。Note. Compared with the cloth mice clothing group, ??P<0.01.

組別Groups固定平均用時(s)Average time to fix A B C D布制鼠衣組Cloth mice clothing group 76.17±8.13 82.50±6.68 77.50±8.96 93.83±8.37小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 48.83±6.20?? 35.33±3.09?? 56.83±8.74?? 47.00±7.00??

2.1.2 后肢回縮次數

對兩組小鼠留針期間后肢出現回縮的次數進行計次統計分析,結果如表2 所示,4 位實驗員使用布制鼠衣或小鼠后肢固定器固定小鼠,其后肢回縮的平均次數比較無統計學差異(P>0.05),但從4 位實驗員各自的固定情況看,使用小鼠后肢固定器時后肢回縮次數相對較少,說明該裝置對小鼠后肢的固定效果一定程度上優于布制鼠衣。

表2 后肢回縮平均次數(±s,n=6)Table 2 Average number of hind limb retraction

表2 后肢回縮平均次數(±s,n=6)Table 2 Average number of hind limb retraction

組別Groups回縮平均次數(次)Average number of retraction A B C D布制鼠衣組Cloth mice clothing group 0.50±0.50 0.33±0.47 0.17±0.37 0.17±0.37小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 0.17±0.37 0.00±0.00 0.17±0.37 0.00±0.00

2.1.3 針具脫落次數

對兩組小鼠留針期間針具出現脫落的次數進行計次統計分析,結果如表3 所示,4 位實驗員使用兩種方法固定小鼠,其針具脫落的平均次數組間比較無統計學差異(P>0.05),而從4 位實驗員各自針刺效果看,使用布制鼠衣固定小鼠,其掙脫時更容易導致針具脫落,而使用小鼠后肢固定器能減少針具的脫落次數。

表3 針具脫落平均次數(±s,n=6)Table 3 Average number of needle shedding

表3 針具脫落平均次數(±s,n=6)Table 3 Average number of needle shedding

組別Groups脫落平均次數(次)Average number of shedding A B C D布制鼠衣組Cloth mice clothing group 0.33±0.47 0.17±0.37 0.17±0.37 0.00±0.00小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.37 0.00±0.00

2.1.4 兩種固定針刺方法對體重的影響

表4 的體重結果顯示,兩組小鼠在實驗前的基礎體重以及四次固定針刺后的體重無明顯差別(P>0.05),表明無論使用何種固定針刺方法,其對小鼠的體重均無明顯影響。

表4 對小鼠體重的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of mice body weight

表4 對小鼠體重的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of mice body weight

組別Groups小鼠體重(g)Mice body weight基礎體重Basic body weight第一次First time第二次Second time第三次Third time第四次Fourth time布制鼠衣組Cloth mice clothing group 21.00±0.52 21.40±0.23 20.92±0.51 21.10±0.78 21.07±0.57小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 21.08±0.27 21.18±0.49 20.82±0.42 20.62±0.82 20.80±0.75

2.2 不同固定方法對小鼠痛閾、認知、情緒等影響的比較

在比較小鼠后肢固定器與布制鼠衣的使用情況基礎上,采用熱輻射痛閾檢測、曠場實驗、高架十字迷宮實驗進一步評估不同固定方法對小鼠痛閾、認知、情緒等指標的影響。 將30 只小鼠按隨機數字表法分為對照組、布制鼠衣組和小鼠后肢固定器組,每組10 只;安排一位實驗員分別在第1 天、第3天、第5 天、第7 天對小鼠進行固定,共計4 次,每次時長30 min;對照組正常飼養不固定,布制鼠衣組使用布制鼠衣固定,小鼠后肢固定器組使用小鼠后肢固定器固定。 于第一次固定前和每次固定后進行熱輻射痛閾檢測,于第四次固定后進行曠場實驗、高架十字迷宮實驗。 實驗結果如下。

2.2.1 不同固定方法對痛閾的影響

表5 的熱輻射痛閾結果顯示,三組小鼠的基礎熱輻射痛閾以及四次固定后的熱輻射痛閾無統計學差異(P>0.05),表明不同固定方法對小鼠痛閾的影響無明顯差別。

表5 對小鼠痛閾的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of mice pain threshold

表5 對小鼠痛閾的影響(±s,n=10)Table 5 Effect of mice pain threshold

組別Groups小鼠熱輻射痛閾(s)PWTL of mice基礎熱輻射痛閾Basic PWTL第一次First time第二次Second time第三次Third time第四次Fourth time對照組Control group 12.92±1.08 11.91±1.15 12.38±0.69 12.58±0.49 12.56±0.58布制鼠衣組Cloth mice clothing group 13.00±0.91 12.66±0.70 12.09±1.13 12.91±0.86 12.62±0.93小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 12.86±0.98 12.23±0.83 12.86±0.56 12.13±0.99 12.54±0.52

2.2.2 不同固定方法對曠場實驗各項指標的影響

表6 的曠場實驗結果顯示,三組小鼠5 min 內的總路程、平均速度、中央區活動路程、中央區活動時間組間比較均無統計學差異(P>0.05),表明不同固定方法對小鼠認知、情緒的影響無明顯差別。

表6 曠場實驗結果(±s,n=10)Table 6 Results of open field test

表6 曠場實驗結果(±s,n=10)Table 6 Results of open field test

組別Groups總路程(cm)Total sport distance平均速度(cm/s)Average speed中央區活動路程(cm)Sport distance in the central area中央區活動時間(s)Sport time in the central area對照組Control group 1976.53±545.22 6.59±1.82 95.43±86.00 5.68±4.59布制鼠衣組Cloth mice clothing group 1990.34±354.38 6.63±1.18 97.64±101.61 5.95±5.41小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 2026.23±323.69 6.75±1.08 90.81±124.63 4.42±5.43

2.2.3 不同固定方法對高架十字迷宮實驗各項指標的影響

表7 的高架十字迷宮實驗結果顯示,三組小鼠5 min 內進入開放臂次數百分比、開放臂停留時間百分比組間比較無統計學差異(P>0.05),表明不同固定方法對小鼠情緒的影響無明顯差別。

表7 高架十字迷宮實驗結果(±s,n=10)Table 7 Results of elevated cross maze test

表7 高架十字迷宮實驗結果(±s,n=10)Table 7 Results of elevated cross maze test

組別Groups進入開放臂次數百分比(%)Percentage of open arm entry開放臂停留時間百分比(%)Percentage of open arm time對照組Control group 44.93±22.38 45.73±30.21布制鼠衣組Cloth mice clothing group 58.95±21.78 55.51±30.78小鼠后肢固定器組Mice hind limb fixator group 44.68±24.50 48.17±29.93

3 討論

不同于針灸臨床試驗,針灸動物實驗能夠進行原本在人體上無法實現的研究,為解開針灸理論與技術的奧秘、解讀針灸作用原理及規律提供了更多可能[1]。 為了保證針灸動物實驗結果的客觀性和可信度,實驗動物固定方法的選擇尤為重要。 文獻中用于小鼠固定的方法主要有手固定法、捆綁法、器具固定法三種[2],不論何種固定方法,其目的都是為了在實驗操作中盡可能地減少實驗動物與操作者雙方因素的疊加影響,因此固定方法應該滿足以下要求:第一,減低應激反應。 固定方法會引起實驗動物的應激反應,如緊張、恐懼等情緒,當前多采用各組同等固定的方式來平衡組間的差異性,合適的固定方法一方面能減少應激反應的產生,減少動物的痛苦,另一方面能夠盡量減少組間的差異[3-5]。 第二,保持合適的體位。 不同穴位的針灸操作對體位的選擇有一定的要求,正確的固定能較好控制動物的體位,減少不必要的刺激,進而保證個體間和組間針刺深度、針刺方向以及行針操作的一致性。 第三,有助于穴位選取。 只有正確的取穴才能準確反映針效,針灸取穴是否精準與固定方法直接相關,實驗動物接受固定后,任何的掙扎、掙脫動作都會導致腧穴定位出現偏差,影響針灸干預的療效[6]。 第四,保證安全。 針灸動物實驗必須注意實驗動物和操作者的安全,不當的固定方法不僅會使實驗動物受傷甚至死亡,導致樣本脫落,而且如若造成動物激惹,操作者會有被咬傷的風險[7]。 第五,固定方法的選擇要考慮實驗成本、操作的簡便性等因素,提高實驗效率亦是選擇合適固定方法的目的之一。

本研究對常用的傳統的鼠衣固定法和新研制的小鼠固定器做了多方面比較,雖然二者對于小鼠的體重、認知、痛閾都沒有影響,但相較于布制鼠衣固定,小鼠后肢固定器所用固定時間及針具脫落次數都有降低,除此之外,小鼠后肢固定器還有以下優勢:一是在小鼠固定期間,布制鼠衣無法判斷小鼠狀態,而透明的小鼠后肢固定器能隨時觀察小鼠,一旦小鼠由于掙扎出現窒息危險,能及時進行解救。 二是柔軟的布制鼠衣在固定小鼠時不易控制松緊度,太松小鼠容易掙脫,太緊則增加小鼠出現應激反應的強度,小鼠后肢固定器則能統一控制固定的松緊程度,以達到平衡組間差異的作用。 三是布制鼠衣不易清潔,為減少殘留氣味對小鼠的影響,每次使用后需清洗晾干才能再次使用,而小鼠后肢固定器使用乙醇噴涂擦拭后即可。 四是實際應用發現,布制鼠衣固定時小鼠的撕咬使得鼠衣損耗較大,而小鼠后肢固定器制作材料易得,制作簡單,損耗極少,從節省實驗成本的角度考量,小鼠后肢固定器更優。

總之,實驗結果和實際應用表明,該小鼠后肢固定器制作簡單,成本低廉,實用耐久,在提高實驗安全性和效率方面優勢明顯,可最大限度地減少固定本身對小鼠的干擾,減少對實驗結果的影響,能夠為針灸實驗研究提供便利,推薦使用。 然其尺寸、樣式并不唯一,使用者可根據不同研究的具體需求,如小鼠體重、取穴部位等進行相應的改良,以達到最佳的使用效果。