水稻雄性核不育突變體ms7的遺傳分析及基因定位

楊晉宇　白琛　丁小惠　申紅芳　王磊　應杰政, *　鄂志國, *

水稻雄性核不育突變體的遺傳分析及基因定位

楊晉宇1, #白琛2, 3, #丁小惠2, 3申紅芳1王磊1應杰政1, *鄂志國1, *

（1中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室, 杭州 310006;2中國科學院 植物研究所 植物分子生理學重點實驗室, 北京 100093;3中國科學院大學，北京 100049;#共同第一作者;*通信聯系人, E-mail: yingjiezheng@caas.cn; ezhiguo@caas.cn）

【】通過對水稻雄性不育突變體的研究，可以鑒定更多與育性或花粉發育相關的基因，有助于解析水稻雄性生殖發育的整個調控網絡。常規種植條件下，突變體()與對照種植于浙江富陽和海南陵水，比較它們的育性及主要農藝性狀差異，利用混池關聯分析和圖位克隆方法進行目標基因定位。整個生育期，突變體生長速率與野生型一致，成熟期的株高、分蘗數、葉數、葉大小、穗長和每穗穎花數等性狀與野生型相比也沒有顯著差異，但結實率為0，表現為完全雄性不育，花藥瘦小且顏色發白，半薄切片顯示絨氈層降解推遲，花粉鏡檢呈染敗。遺傳分析表明花粉敗育受單個隱性基因控制，定位于第7染色體上BSA11與YD7045之間1.17 Mb的范圍內。本研究為水稻雄性不育基因的克隆和功能研究打下了基礎。

水稻；雄性不育；混池關聯分析；基因定位

水稻是我國乃至東南亞最重要的糧食作物，在我國有著悠久的種植和馴化歷史[1]。水稻細胞核雄性不育系的發現及應用，推動了雜交水稻從三系到兩系的發展，為我國乃至世界糧食安全發揮了重要作用[2]。目前生產中利用的水稻核不育系多是光溫敏雄性核不育系，相應的控制基因如[3]、/[4-5]、等也已鑒定。近年發現一種新型濕敏雄性核不育現象，突變體在低濕環境(相對濕度<60%)下因花粉不能有效防止脫水而無法完成粘附和水合作用，造成不育，而高濕環境(相對濕度>80%)下恢復育性[8-10]。除這種環境和遺傳因子互作外，還有諸多影響小孢子和花粉發育的因素，而絨氈層發生和降解異常是重要原因之一。絨氈層位于花藥壁最內層，通過細胞程序化死亡(programmed cell death, PCD)，為小孢子的發生發育提供營養，分泌脂質參與花粉外壁建成和花藥角質層合成[11]。F-box蛋白OsADF、半胱氨酸蛋白酶OsCP1[13]、天冬氨酸蛋白酶OsAP25和OsAP37[14]等，可通過蛋白水解通路直接參與絨氈層的PCD脂肪酸還原酶DPW[15]、α整合素樣蛋白DPW3[16]、酰基輔酶A合成酶[17]、酰基轉移酶DPW2[18]和酰基轉移酶OsGPAT3[19]，通過參與脂質代謝，影響絨氈層PCD和花粉外壁前體物質合成。此外，鈣離子結合蛋白Ca。OsAGO2通過DNA甲基化直接下調己糖激酶基因表達，影響絨氈層活性氧積累，敲低或過表達都能導致PCD提早和花粉敗育[21]。

在絨氈層發育調控網絡中，MYB轉錄因子GAMYB[22-23]和BM1[24]，bHLH轉錄因子UDT1[25]、TIP2[26-27]、TDR[28]和EAT1/DTD[14, 29]，E3泛素連接酶OsHUB1和OsHUB2[30]，PHD鋅指蛋白PTC1/OsMS1[31-33]和凋亡抑制因子API5[34]等都起重要作用。TDR作用于GAMYB和UDT1下游，通過直接調節、和等基因的表達，激活蛋白水解通路從而引發絨氈層降解[12, 23, 28]。EAT1/DTD作用于TDR下游并能與TDR互作，通過上調和表達，正調控絨氈層PCD[14, 29]。TIP2/bHLH142能直接調控和的表達，且TIP2能與TDR互作，從而調控絨氈層PCD[26-27]。OsMS1和TIP3都具有轉錄激活活性，它們分別通過與TIP2和TDR互作，調控烏氏體發生和絨氈層降解[32-33]。OsHUB1和OsHUB2作為E3連接酶，通過組蛋白H2B單泛素化，正調控、和表達，影響絨氈層降解[30]。ATP檸檬酸裂合酶ACL催化細胞質中的檸檬酸生成草酰乙酸和乙酰輔酶A，通過影響、、和等基因的表達，調控絨氈層PCD。ACL突變體絨氈層細胞過早降解，花藥中ATP水平和脂肪酸含量降低，不能形成有活性的花粉[35]。這些表明，在花藥壁的分化、發生和降解過程中，TIP2、TDR和EAT1這3個bHLH轉錄因子可能起核心調控作用。編碼一種AAA-ATP酶，與RAD51和DMC1互作，參與減數分裂的染色體雙鏈斷裂修復，但突變體絨氈層降解異常，是導致花藥異常和小孢子敗育的原因之一[36]。此外，生殖細胞也能調節絨氈層PCD。編碼一種糖蛋白，被小孢子分泌到細胞外與絨氈層細胞表面受體互作，調控絨氈層PCD和小孢子發育[37]。

我們在對秈稻中恢161進行組培實驗時，從其后代中鑒定出一個雄性不育突變體，也表現為絨氈層降解滯后和花粉敗育，其他表型在整個生育期與野生型沒有顯著差異。進一步用潮霉素基因的分子標記對后代不育個體進行PCR鑒定，在無篩選標記的個體中依然表現為不育，表明不育性狀并非由遺傳轉化載體結構T-DNA插入而產生，推測可能是組培過程中產生了新的遺傳變異導致中恢161細胞核雄性不育。為了明確雄性不育產生的原因，我們用作母本，IR96671為父本構建遺傳群體進行遺傳分析，結果表明的不育性狀受單個隱性核基因控制。經混池關聯分析（bulked segregant analysis, BSA）和基因定位，將定位于第7染色體上BSA11－YD7045之間，這些結果為進一步的基因克隆和功能分析打下了基礎。

1?材料與方法

1.1?供試材料

本研究采用的突變體是秈型恢復系中恢161經組織培養產生的，該突變體在杭州富陽和海南陵水均表現為雄性完全不育，不受溫度和日照影響。常規秈稻IR96671作為雜交親本構建遺傳分析和定位的群體。

1.2?群體構建及遺傳分析

突變體為母本，秈稻品種IR96671為父本，配制雜交組合，觀察F1的表型，分單株收獲種子。在F2群體中統計野生型和不育型的分離比例，用于遺傳分析、BSA分析和基因定位。所有材料2018?2019年種植于中國水稻研究所杭州富陽實驗基地和海南陵水基地，正常田間管理。

1.3?花粉育性調查

抽穗期當日開花前，田間取回野生型和不育型的穎花，在顯微鏡下觀察花藥表型并拍照。用1% I2-KI溶液進行染色，觀察野生型和不育型花粉染色的情況并拍照。

灌漿后期觀察單株灌漿結實情況，記錄植株育性。

1.4?花藥半薄切片觀察

取野生型和不育型不同發育時期的小花，在FAA固定液（甲醛∶冰乙酸∶50%乙醇=5∶5∶90）中固定，抽真空至樣品全部沉底，換用新的FAA常溫保存備用。挑選不同時期的小花剝去穎殼露出花藥后用酒精進行梯度脫水，接著在飽和番紅水溶液中處理2～3 h，再使用Technovit 7100試劑盒進行滲透包埋，60℃恒溫烘箱中烘烤4 d。修塊后用半薄切片機（Leica RM2265）橫切花藥，切片厚度為2 μm，經甲苯胺藍染色后用光學顯微鏡觀察拍照。

1.5?全基因組測序

在×IR96671的F2群體中，根據育性的分離分為可育型和不育型兩組，從中分別挑選出30株，采用簡易DNA提取法分單株提取葉片DNA，檢測每份DNA的品質與濃度后等量混合制備混池。利用超聲波將DNA序列片段化形成隨機片段，對片段化的DNA進行末端修復、3′端加A、連接測序接頭后，富集400 bp左右的隨機片段，經PCR擴增形成測序文庫。文庫經質檢合格后，用Illumina HiSeqTM平臺進行測序，測序策略為Illumina PE150，總測序讀長為300 bp。

對測序數據進行質量控制，過濾掉低質量數據。利用BWA軟件[38]將質控后數據比對到參考基因組(IRGSP1.0, http://rice.Plantbiology.msu.edu/)上，獲得序列的位置。利用GATK軟件對位置歸屬校正，并進行SNP檢測[39]，同時利用Samtools軟件的Vcfutils工具進行過濾[40]，獲得高質量的變異位點。采用Annovar軟件和參考基因組的基因預測信息進行注釋。基于親本和突變混池的數據特點，計算SNP指數進行BSA關聯分析，定位目標突變位點。

1.6?差異位點的關聯分析

對所得到的SNP和InDel位點進行親本和突變混池的差異位點開發，計算每個差異SNP位點的指數，即突變基因型在突變池和野生池中所有基因型中所占的比例。由于突變位點與周圍標記的連鎖效應，在突變位點附近，SNP指數更接近于1，其余位點由于高通量測序的隨機分布，應符合孟德爾分離比例，本研究的突變性狀屬于隱性突變，在F2群體中，突變位點的SNP指數為1，正常位點為0.5。

為了消除假陽性位點，利用標記在基因組上的位置，用滑窗的方法將SNP指數進行擬合，消除由于隨機擴增導致的差異突變。計算每個變異位點的指數，以染色體物理位置為橫坐標繪制曲線圖，計算所有SNP指數在95%、99%及99.9%置信水平下的閾值，挑選高于閾值的區域作為候選區間。

1.7?DNA提取和定位分析

基于BSA分析得到的初步定位區間，根據親本材料重測序結果，利用Primer 5.0軟件設計位于該區域的InDel標記，標記分布區域完全覆蓋BSA分析得到的關聯區間，并向左右各擴展數兆區間。挑選多態性標記用于驗證BSA測序結果及篩選F2群體中的重組單株。除大田種植外，F2群體同時也在光溫培養箱中進行水培。大田材料在移栽一周后取回葉片使用簡易法提取DNA，水培材料在播種10 d后使用簡易板提法提取葉片DNA。

PCR擴增使用北京康為世紀生物科技有限公司的10 μL反應體系：模板DNA 1 μL、10 μmol/L前后引物各0.5 μL、2×Taq MasterMix預混液5 μL、滅菌水3 μL。擴增程序如下：94℃下預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s（根據不同引物TM值修改），72℃延伸30 s，共計30個循環；最后72℃延伸2 min。PCR擴增產物依據片段大小采用2%或2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后經Gel Red染色檢測，然后拍照保存統計帶型。挑出目標區域內的重組單株后重新取樣鑒定，對最終確認的重組單株進行目標區域的其他標記檢測，移栽到大田，待灌漿完成后記錄育性。

2?結果與分析

2.1?突變體ms7表型分析

自然生長條件下，突變體全生育期生長速率與野生型中恢161一致，灌漿前表型沒有明顯異常，包括株高、分蘗數、葉數、葉大小、穗長和每穗穎花數等性狀與野生型相比沒有顯著差異（圖1-A）。但不灌漿，結實率為0。用野生型花粉授粉后，能正常結實，表明雌蕊發育正常，該突變體為雄性不育（圖1-B）。與野生型相比，花藥瘦小且顏色變淡發白（圖1-C）。花粉鏡檢發現的花粉粒無法被1% I2-KI溶液染色或染色不均，為染敗，表明花粉無活性，而野生型花粉粒能全部染成深色（圖1-D）。

2.2?花藥半薄切片分析

根據張大兵等[41]將花藥發育所分成的14個時期，可通過花藥半薄切片來比較觀察野生型和突變型在花藥發育過程中存在的差異。在1～8a時期，突變體的花藥發育形態與野生型相比無明顯差異，花粉母細胞進行正常的減數分裂并形成了二分體(圖2-A、圖2-G)。在8b時期，小孢子母細胞繼續進行減數分裂，形成四分體。此時，野生型的絨氈層開始液泡化并伴隨著細胞程序性死亡(圖2-B)，突變體的絨氈層出現大量空泡(圖2-H)。第9時期，隨著胼胝質壁的降解，自由的單倍體小孢子從四分體中釋放了出來，游離在藥室中。野生型的絨氈層中空泡逐漸被吸收，細胞質繼續濃縮，顏色加深(圖2-C)，突變體的絨氈層仍可見空泡(圖2-I)。第10時期，小孢子液泡化，野生型的絨氈層進一步退化(圖2-D)，突變型的絨氈層卻明顯增厚(圖2-J)。第11時期，液泡化的小孢子進行第一次不對稱的有絲分裂，產生一個較小的生殖細胞和一個較大的營養細胞。野生型的絨氈層繼續降解(圖2-E)，而突變型的絨氈層仍無降解表現(圖2-K)。第12時期，小孢子內的生殖細胞進行了第二次有絲分裂，野生型中成熟的花粉粒由于淀粉粒和油脂的積累，細胞內充滿儲存物，表皮和藥室內壁進一步降解，絨氈層完全消失(圖2-F)；突變體僅有極少數小孢子填充有淀粉，但缺少油脂，絕大多數小孢子表現為形狀不規則的空泡，無填充物(圖2-L)。

A―灌漿期的植株形態；B―ms7和野生型的結實情況；C―ms7和野生型的穎花形態；D―ms7和野生型的花粉碘化鉀染色。

Fig. 1. Phenotype ofand its wild type Zhonghui 161.

2.3?突變體ms7雄性不育性狀的遺傳分析

以突變體為母本，IR96671為父本構建了×IR96671群體。考查F1植株的花粉育性，發現F1結實率與野生型相當，表明突變性狀受隱性基因控制。統計了4個F2群體的可育型和不育型植株數，經卡方檢驗，≈0.43>0.05，正常育性與雄性不育個體的分離比符合3∶1（表1），說明的雄性不育性狀受單個隱性核基因控制。

A～F為野生型花藥在8a至12時期的切片；G～L為突變體花藥在8a至12時期的切片。

A?F, Wild-type anthers from stages 8a to 12; G?L,anthers from stages 8a to 12.

Ep―表皮；En―內壁；T―絨氈層；Dy―二分體；Tds―四分體；Msp―小孢子；BP―二胞花粉；MP―成熟花粉粒；iMP―未成熟花粉粒。標尺為20 μm。

Ep, Epidermis; En, Endothecium; T, Tapetum; Dy, Dyad cell; Tds, Tetrads; Msp, Microspore; BP, Biceullar pollen; MP, Mature pollen; iMP, Immature pollen. Bar=20 μm.

圖2?野生型中恢161和突變體不同發育時期花藥半薄切片觀察

Fig. 2. Contrast of slice of anther between themutant and its wild type.

2.4?BSA分析初定位ms7雄性不育基因

4個樣本池測序并過濾后共獲得87.59 G的數據，Q30達91.79%，樣品平均覆蓋深度43.72X，與參考基因組平均比對效率為79.49%，基因組覆蓋度96.02%。這些數據表明測序數據充足，質量高，可用于下一步分析。

SNP分析表明，4個樣本共獲得3 905 483個SNP位點，其中非同義突變的SNP有1 482 935個。SNP信息統計顯示，不同樣品的轉換與顛換兩種類型SNP比率（i/v）大致相當（表2）。與親本池相比，兩個子代混池樣本中純合基因型比率明顯降低，分別為38.00%和38.82%，表明雜交增加了子代的雜合SNP率。

表1 ms7中雄性不育性狀的遺傳分析

表2 SNP數據統計表

進一步對兩個極端性狀混池的SNP-index在染色體上的分布情況進行統計，計算兩個子代混池的|ΔSNP-index|，結合性狀進行關聯分析后發現，當置信度為0.999時，第7染色體上15.5?16.7 Mb位置被篩選為候選區域（圖3）。

曲線是變異位點在染色體上所對應的Index值；紅、綠和藍三根線分別是95%、99%和99.9%置信區間閾值線。

Fig. 3. Distribution of SNP-index on the chromosomes.

2.5 雄性不育基因ms7的定位

為了驗證測序結果并進行下一步的精細定位，我們根據兩個親本和IR96671的重測序結果在第7染色體長臂上設計了62個InDel標記，涵蓋了BSA分析99.9%閾值對應的關聯區間，并向兩端延伸至區間7 968 748?21 483 477。對用于混池分析的材料按單株進行基因分型驗證，確定基因的候選區間為15.0 Mb?18.4 Mb (15 032 966? 18 400 602)。從中篩選8個親本間多態性明顯的InDel標記對F2群體中剩余個體進行基因型鑒定，并結合各單株的育性表型，進一步縮小控制育性的定位區間（表3）。

表3?8個InDel標記的引物信息

根據約14 000株F2群體的實驗結果可挑選出7種類型重組單株，其基因型和表型數據如圖4所示。其中，R1-R7是不同的單株，S表示該株不育，F表示該株可育。通過這7個單株我們將界定于第7染色體上BSA11(16.97 Mb)與YD7045 (17.99 Mb)之間約1.17 Mb的范圍內。為了驗證定位的結果，在BSA11?YD7045之間挑選雜合型材料發展群體在實驗室培養箱種植，經標記檢測，群體出現正常的基因型分離，從中挑選不同基因型的材料種植于溫室，其結果顯示，具有純合型的單株均表現為不育，而雜合型和父本型均可育，此結果與定位結果一致。

2.5?GO分析

水稻第7染色體BSA11和YD7045間約1.17 Mb的物理區間內，根據日本晴參考基因組預測，共有137個基因位點。其中，已克隆的僅()[41]。剩下的136個位點中，根據基因本體(gene ontology, GO)注釋分析，轉座子或逆轉錄轉座子合計51個，其他預測具有生物學功能的位點42個。從分子功能看，能與蛋白結合(GO: 0005515)的9個，具有轉移酶活性(GO: 0016740)的8個，具有水解酶活性(GO: 0016787)的7個，等等；從生物學進程看，和預測參與花發育進程(GO:0009908)，和預測參與細胞死亡過程(GO: 0008219)，另有參與核酸類物質代謝(GO: 0006139)的11個，參與脂質代謝(GO: 0006629）的4個，參與碳水化合物代謝(GO: 0005975)的2個，參與底物運輸(GO: 0006810)的4個。

3 討論

本研究利用組培獲得了水稻雄性不育突變體，除花粉敗育外其他表型與野生型沒有差異，遺傳分析表明該性狀受單個隱性核基因控制。水稻中已鑒定的影響育性的核基因中，如這樣造成花粉完全敗育，但又不影響胚囊或其他營養器官發育的基因，并不多見。

圖4 重組單株的基因型組成和育性表現

Fig 4. Genotypic composition and fertility performance of recombinant plants.

突變體中控制雄性不育的基因定位在第7染色體上的InDel標記BSA11和YD7045之間，該區間內預測有基因位點137個。根據RiceXPro表達譜數據庫（https://ricexpro.dna.affrc. go.jp/），共有42個基因在花藥中有表達，相對表達量最高的是，預測編碼絲氨酸羧肽酶，較高的有、、、和等，未發現花藥特異表達基因。這些位點中，僅/得到鑒定。據報道，OsMSH4能與OsMSH5互作，形成異源二聚體，調控減數分裂過程中交叉的形成。突變體從終變期開始異常，導致雌雄配子均沒有功能，花粉和胚囊均不育[42]。由于僅雄配子異常，與不同，推測它們不是同一位點突變。

本文對定位的物理區間1.17 Mb，仍然偏大，當中遺傳因子眾多，那些預測有生物學功能的位點，以及其他尚未注釋的位點，都可能是的候選基因。為了確認基因在中是否有變異，我們將中恢161和中的DNA序列分成13段，通過PCR擴增后送公司測序，初步分析發現兩者無差異。此外，為了能快速定位到目標位點，我們正對中恢161和進行第三代測序，嘗試通過長序列的拼裝，結合BSA二代測序結果，希望能直接找出與野生型在目標DNA區間上的差異。

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Genetic Analysis and Gene Mapping of a Male Sterile Mutantin Rice

YANG Jinyu1,#, BAI Chen2,3,#, DING Xiaohui2,3, SHEN Hongfang1, WANG Lei1, YING Jiezheng1,*, E Zhiguo1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China;3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;#These authors contributed equally to the work;*Corresponding author, E-mail: yingjiezheng@caas.cn; ezhiguo@caas.cn)

【】Genes related to pollen development and fertility can be identified through the study on male sterile mutants, which is helpful to analyze the whole regulatory network of male reproductive development in rice. 【】The fertility and agronomic traits of the() mutant and its wild type were compared under conventional planting conditions in Fuyang, Zhejiang and Lingshui, Hainan. The sterile gene was mapped by bulked segregant analysis and map-based cloning.【】During the whole growth period, the growth rate ofmutant was the same as that of wild type, and there was no significant difference in plant height, tiller number, leaf number, leaf size, panicle length and spikelets per panicle betweenand its wild type. However,exhibited slender and white anthers with inactive pollen grains which couldn’t be stained with I2-KI, and no seeds were produced. Observation results of anther cross-sections exhibited that tapetum programmed cell death (PCD) was delayed. Genetic analysis showed that pollen abortion was controlled by a single recessive nuclear gene, which was mapped to a 1.17 Mb region between BSA11 and YD7045 on chromosome 7. 【】It will contribute to the further molecular cloning and functional analysis of male sterile genein rice.

rice; male sterile; bulked segregant analysis; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2022.210302

2021-03-03；

2021-04-19。

浙江省自然科學基金資助項目(LY17G030031); 國家自然科學基金面上項目(32072050, 71773140); 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(CPSIBRF-CNRRI-202129)。