真空冷凍干燥技術在水痘減毒活疫苗中的應用

霍子奇，張賀惟，韓文超，柏 爽，閆 磊

（長春祈健生物制品有限公司，吉林 長春130012）

生物制藥行業的發展與生產技術有直接關聯，在多種生物制藥技術的輔助下，提升中國生物制藥的水平。真空冷凍干燥技術在水痘減毒活疫苗中的運用可提升其使用效果，延長保存時間，有效提升凍干工藝使用質量，有利于制藥行業的發展。

1 凍干的原理

水可以分成三相，分別是氣態、液態與固態，結合熱力學有關知識理論能夠知道，壓力的降低可以促使水的冰點與沸點之間相互重合。然后采用加熱的處理方法，冰便會從液態直接經過升華過程變為氣態。凍干過程的原理便是應用低壓低溫狀態下水三相的具體變化，首先針對需要進行干燥處理的物料予以降溫凍結處理，令物料中以液態形式存在的水可以變為以固態存在的冰，之后在真空的狀況下針對物料實施相應的加熱處理，這樣冰會直接升華變為水蒸氣而從中除去，便可以獲取低溫脫水相應的干燥制品。一個比較典型的冷凍干燥工藝過程，通?？梢苑殖珊銐航禍亍⒑銣亟祲汉秃銣厣郎貛讉€熱力學過程。

2 水痘減毒活疫苗在凍干工藝上存在的問題

近幾年生物制藥技術快速發展，不斷產生新的多肽蛋白類藥物，可運用于臨床中的蛋白酶、疫苗、多肽與脂質體等成為研發重點。而這些藥物有個共性問題，就是都屬于熱敏性藥品，為了防止熱敏性藥物在生產過程中溫度過高而對藥物產生不利的影響，同時也便于藥物的運輸及儲存，目前使用冷凍干燥法將其制備成固態的藥品[1]，經歷幾十年的發展，藥物冷凍干燥技術已經有了很大的進步，但仍然存在問題[2]，例如在冷凍干燥的時候會產生多種干燥與凍結應力，因此也會令藥物產生變形和外觀的完整性受損。另外凍干法自身也有干燥時間長、速率低于能源損耗高的情況。借此為了提升藥物的穩定性，需加強對凍干工藝的優化。除此之外，水痘減毒活疫苗為凍干注射劑，滴度不好保持，且在自由細胞懸浮液中不穩定，以凍干工藝，進行大規模生產時候若不能科學控制，都會導致水痘減毒活疫苗中滴度、水分、真空度、外觀（萎縮：整體縮小、下沉、缺肉）等多種指標低或者不合格，因此在水痘減毒活疫苗生產中，使用真空冷凍干燥技術意義重大。

3 凍干參數的設計

凍干參數的設計會受到眾多方面因素的影響，由于文章篇幅比較有限，這里簡要列舉其中一些影響因素。

3.1 凍結方式的影響

關于凍結方式，可以分成兩種不同類型，分別是全域過冷結晶和定向結晶。采用不相同的凍結方式，其形成冰晶的形態及大小也會存在一定的差異，同時也會導致制劑相應的干燥速度與凍干質量受到一定影響，因此應用良好的凍結方式是極為關鍵的。全域過冷結晶指的是所有的溶液在處在相同或是相近的過冷溫度狀態下實施凍結處理，根據凍結的實際速率分成快速凍結與慢速凍結兩種不同方式。全域過冷結晶中，冰晶成核溫度與凍結速率是其中比較主要的參數。定向結晶指的小部分溶液在過冷的狀況下實施凍結處理的一種方式。一般情況下，應用定向結晶方法的凍結藥液相應的干燥速度相較于全域過冷結晶明顯更快。然而不管是采用何種凍結方法，藥液都需要保證部分或是全部地完成玻璃化凍結，以確保相應的藥性。

3.2 凍結溫度的影響

對于凍結溫度，其結合采用預凍方法的不同和樣品性質的不同，其結果也不盡相同。通常來講，凍結溫度和藥液的共晶之間存在著密切的關聯性，安全的凍結溫度需要小于共晶點約10℃。如果凍結溫度過低，那么便會導致能源浪費情況的出現。

3.3 凍結時間的影響

設定合理的凍結時間能夠確保藥液在完成干燥處理以前被凍牢，這樣可以避免由于抽真空出現噴瓶的情況。凍結的時間需要結合傳熱介質、板層面積等方面加以定奪，通常在1～3 h內會完全性凍結。

3.4 退火的影響

退火是將凍結疫苗進行升溫處理，使其接近相應的共熔點，且進行一定時間的保溫，之后溫度降低至凍結溫度的處理環節。在升華前增加相應退火處理工藝的原因如下：首先，是因為退火溫度超過凍結樣品玻璃化轉化溫度Tg，這樣更加利于溶液中含有的結晶成分和濃縮液中沒有凍結的水進行完全性的結晶，加強了結晶這一過程；其次，提升非晶相最大凍結濃縮液相應的玻璃轉化溫度Tg，這樣可以具有更高的穩定性；最后，退火環節中的相行為和重結晶，能夠減低由于成核溫度差異所造成的冰晶在尺寸上的差異，實現對冰晶形態和大小分布情況的有效調節，提升相應的干燥效率。要想使得退火工藝相應的目的得到良好實現，實際操作中需要關注加熱的速率，退火的時間和退火的溫度等相關參數。因為當前對于凍干中的退火機理認識依然不是十分清晰，所以，退火工藝相關參數的選擇也缺少一定的根據。

3.5 升化溫度的影響

關于升華溫度，不可以高于已干層相應的崩解溫度，同時也不可以高于凍結層相應的共熔點溫度。若是升華溫度遠遠小于共熔點溫度，那么升華的速度便會顯著下降，相應的時間也會有所延長。若是高出共熔點相應的溫度，那么物料便會出現熔化的情況，在干燥過后物料可能會產生溶解困難的問題，且會出現顏色加深等情況。所以在升華階段物料的溫度應盡可能與共熔點溫度接近，但不可以高于這一溫度。與共熔點溫度越是相近，相應生升華的速度也就越快。升華干燥這一階段，凍干箱的擱板是物料熱量相應的來源，通常依賴于上擱板的熱輻射與下擱板的熱傳導兩種不同方式予以熱量的提供。所以，擱板的溫度需要保持在相對合理的范圍中，通常結合升華溫度、冷阱溫度和凍干箱中的壓強幾方面因素加以確立。

3.6 升華速度的設計

升華速度會對凍干工藝相應的時間造成一定的影響，對應的大小與提供給升華界面的熱量及其由升華界面經過干燥層而逸出水蒸氣的快慢之間存在一定的關聯。在升華干燥時，如果真空度不足或是供熱不夠有可能會造成成品水分的升華不是十分完全，出現含水量較高的情況。過快的升華速度極為可能導致凍干層相應的結構受到一定的破壞，情況比較嚴重時，還會導致噴瓶問題的產生，促使凍干失敗。進行冷凍干燥處理旨在可以獲取合格且具有一定均一性的產品，所以對于升華速度的控制需要將此作為標準。升華干燥相應的理想狀態是確保藥品質量的重要基礎，應盡量提升升華的速度。對于提升升華速度的措施可以歸結如下：盡量提升升華中相應的溫度，減小冷阱溫度，變更干燥室中的壓力，提升已干層所具有的導熱性，減少已干層相應的厚度。通常來講，性能比較良好的冷凍干燥劑對應的升華時間也比較短。

3.7 解析干燥階段的影響

冷阱溫度、物料溫度、干燥時間和箱內壓強是解析干燥環節比較常見的相關控制參數。這一環節需要將產品中存在的結合水除去，所以擱板應提供充足的熱量，用以對水的結合力加以克服，讓產品溫度升高到其最高的準許溫度，并保持幾個小時的時間直至凍干過程結束。物料的最高準許溫度應結合物料的品種加以定奪，通常需要保持在20～40℃范圍內。如果物料溫度超出相應的極限值，疫苗中的相關有效成分便會出現變質的情況，導致疫苗效果的下降。要想確保結合水能夠順利從中除去，凍干箱中需要保持高真空，確保物料內外可以形成比較大蒸汽壓，這樣可以有效提高相應的傳質效率。另外，在接下來的干燥期間，需要盡量減小冷阱溫度。升華干燥需要的時間主要取決于水分的殘留量，針對包含熱敏性成分的疫苗，為了避免其中含有的成分發生變性或是失去活性的情況，高溫的時間不可過長。

4 真空冷凍干燥技術在水痘減毒活疫苗中的運用

4.1 選擇凍干機性能

冷凍干燥（又稱“真空冷凍干燥”或“升華干燥”，簡稱“凍干”）是將富含水的物料利用升華的原理在真空條件下使物料脫水的一種干燥技術[3]，實現冷凍干燥技術的設備稱為凍干機，而凍干機性能的選擇是真空冷凍干燥技術的關鍵。在使用該技術實施水痘減毒活疫苗的生產與儲存時，需依據疫苗的生產工藝規程（關鍵工藝參數和關鍵質量屬性）與生產需求，分析凍干機的性能，并在規范規定的輔助下，選擇最適合的凍干機設備。對于凍干機性能的選擇需要注意：①凍干機的規格、容量、隔板尺寸等需與實際生產量相符。在此使用上海東富龍科技有限公司生產的真空冷凍干燥系統——LYO-20型真空冷凍干燥機。②凍干機隔板正反面都需平整，保障板溫的均勻[4]。③保證冷凝器的溫度在4 h就可降到一定溫度，即不超過40℃。④箱體中的真空度需保持在45 min內達到2 Pa以下，為水痘減毒活疫苗后期干燥環節提供對應的環境，同時避免蒸汽冷凝管與凍干箱體產生真空泄漏的情況，則在使用前要先對外壓部件進行泄漏量測試，避免發生藥品污染。

4.2 技術運用過程

4.2.1 預凍階段

預凍階段是凍干機真空冷凍干燥過程的一個重要環節，預凍過程是一個液相變為固相的過程。預凍的方法基本有兩種，一種是在凍干機干燥室內直接進行預凍的箱內法，另外一種是箱外法，配套超低溫冰箱或者低溫冷庫系統進行低溫冷凍。

箱內法是在凍干箱內預凍，盛裝疫苗的容器直接放置在凍干箱的板層上冷凍干燥，直至出箱，不需要轉移，比較方便；而箱外法一般是大型凍干機生產，提高凍干生產效率，直接在低溫冷庫進行預凍，然后再移入大型凍干機干燥室內進行真空冷凍干燥。根據水痘減毒活疫苗的生產工藝及產品特點，選用箱內法進行凍干生產。而影響疫苗凍干生產預凍階段的兩個重要參數是預凍速度和預凍溫度。

一方面，預凍速度。預凍過程在較大程度上決定水痘減毒活疫苗的質量，在此使用預凍方法進行實驗[5]。實驗目的：考察速凍法對水痘減毒活疫苗外觀與活性的影響。實驗方法：取一半疫苗產品實施速凍實驗，先用凍干箱預冷，然后在裝箱開始就保證容器內的溫度在﹣40℃以下，對凍干工藝曲線與凍干后外觀、病毒滴度等要素進行考察，實施對比。速凍法預凍速度對凍干工藝曲線、凍干后外觀病毒滴度等要素分析如表1所示。

表1 速凍法預凍速度對凍干工藝曲線、凍干后外觀病毒滴度等要素分析

另一方面，預凍溫度。水痘減毒活疫苗的預凍最低溫度取決于其共熔點溫度，所以預凍的最低溫度需低于本產品的共熔點溫度。以固定產品為目的，進行真空中的升華。若水痘減毒活疫苗沒有凍實，抽真空時產品就會溢出；若預凍溫度過低，不但會影響水痘減毒活疫苗的存活率，還會浪費資源。結合水痘減毒活疫苗形態變化，在實驗中使用慢凍法，這樣更好觀察產品溫度與形態變化的關系，反復確認后，建議水痘減毒活疫苗使用﹣45℃的預凍溫度。

4.2.2 升華階段

升華階段也稱第一階段，是真空冷凍干燥的關鍵階段，大部分的水在這一階段被升華。此階段是將凍結后的疫苗置于密封的真空容器中加熱，其冰晶就會升華成水蒸氣逸出，使疫苗確保在沒有水的情況下完成干燥任務。

水痘減毒活疫苗中水升華驅動力為冷阱間與藥物的溫度差，基于藥物溫度受加熱形式的限制且要地域共熔溫度，因此冷阱溫度要低。

以控制溫度與控制時間分別為30℃與5 h、33℃與4 h、35℃與3 h進行對比分析[6]，考察水痘減毒活疫苗在冷凍干燥過程中的熱敏感程度，如表2所示。雖然30℃與35℃都能縮短水痘減毒活疫苗凍干期，但是對病毒滴度的指標有一定的影響，最佳溫控溫度與時間為30℃與5 h[7]。

表2 水痘減毒活疫苗控溫溫度篩選結果

4.2.3 解析干燥階段

解析干燥階段也稱第二階段干燥。水痘減毒活疫苗在升華階段干燥結束水分升華為水蒸氣后，在其內部產生大量空隙，可能還殘留水分，吸附在干燥物質的毛細管壁和極性基團上，若不及時對其進行處理，會影響其儲存效果，因此要對水痘減毒活疫苗進行解析干燥處理，以確保水痘減毒活疫苗的含水量控制在1.8%以內。

隨著中國生物制藥技術的發展，真空冷凍干燥技術作用愈加提升，其在水痘減毒活疫苗中的運用，不但可突破在生產過程中的多種局限，還能延長保存時間與治療效果[8]。經過上述介紹，真空冷凍干燥技術在水痘減毒活疫苗中的運用，經過對預凍階段、升華階段與解析干燥階段進行詳細分析，為生物制藥產業的發展與推廣提供技術支持。