陸澤峰,黃 和,黃湘湄,黃偉鎮
低氧脅迫對珍珠龍膽石斑魚氧化應激及能量代謝的影響
陸澤峰,黃 和,黃湘湄,黃偉鎮
(廣東海洋大學食品科技學院, 廣東 湛江 524088)
【目的】探究保活運輸中低氧脅迫對珍珠龍膽石斑魚()氧化應激的影響。【方法】誘導體質量為(498.2 ± 27.3)g的雜交石斑魚進入休眠狀態,并放置在溶解氧為(1.74 ± 0.21)mg·L?1的低氧環境下,低氧脅迫0、6、12、24、48、72 h后,取樣測定血清應激指標,肌肉、肝臟、鰓組織氧化應激指標及肌肉、肝臟能量利用指標。【結果】低氧脅迫過程中,雜交石斑魚血糖含量在脅迫6 h時最大,72 h時恢復脅迫前水平;皮質醇含量在脅迫過程均顯著高于脅迫前;肌肉超氧化物歧化酶(SOD)活性隨脅迫時間的增加而上升,肝臟、鰓SOD活性先上升后下降;肌肉、肝臟過氧化氫酶(CAT)活性呈先升后降的趨勢,鰓CAT活性在脅迫12、72 h顯著低于脅迫前;肌肉、肝臟丙二醛(MDA)含量在脅迫過程中均增加,鰓MDA含量先降后升;肌肉谷胱甘肽還原酶(GSH)含量在脅迫12 h達到最大值,肝臟GSH含量呈先上升后下降的趨勢,鰓中GSH含量在12 h時顯著高于脅迫前,之后逐漸升高;總抗氧化能力(T-AOC)在肌肉、肝臟、鰓中均呈上升的趨勢;肌肉和肝臟中糖原的含量顯著減少,肌肉乳酸脫氫酶(LDH)活性顯著增加,肝臟LDH先降后升。顯著性水平均為0.05。【結論】低氧脅迫會刺激珍珠龍膽石斑魚產生應激反應,影響體內正常的氧化應激系統,并對不同組織造成不同程度的氧化損傷。
珍珠龍膽石斑魚;低氧脅迫;氧化應激;能量代謝
溶解氧是影響魚類生存的重要環境因素之一。由于水溫變化、晝夜更替及生物呼吸作用變化,水體溶解氧含量不斷變化[1]。一般地,水體溶解氧含量維持在4.0 mg·L?1以上時,魚類才能正常的生長繁殖;在低氧環境下,易誘發魚體氧化應激反應[2],導致呼吸、代謝紊亂[3],影響自身正常生理機能和組織器官功能[4],甚至導致魚體死亡。
珍珠龍膽石斑魚(),俗稱龍虎斑或珍珠斑。其營養豐富,味道鮮美,深受廣大消費者的喜愛。我國珍珠龍膽石斑魚的人工養殖地主要集中在東南沿海地區,并主要通過有水運輸的方式將鮮活魚體輸送到各地[5-6]。在集約化養殖中,通常使用空氣泵充氧或用循環水系統使溶解氧保持在較穩定水平(> 5 mg/L)[7],在長距離運輸過程中,溶解氧含量易受水質變化、人為操作等影響而減少,造成急性低氧應激。目前,少見關于低氧脅迫對珍珠龍膽石斑魚應激脅迫的研究報道。本研究通過靜態模擬珍珠龍膽石斑魚的保活運輸過程,探究該石斑魚在低氧脅迫下不同組織氧化應激和能量利用指標變化,為珍珠龍膽石斑魚保活運輸提供理論依據。
實驗用珍珠龍膽石斑魚于2021年4月購自湛江市霞山東風水產品批發市場,體表無損傷,健康無病害,體質量為(498.2 ± 27.3)g,加水充氧運至廣東海洋大學第三實驗樓實驗室暫養24 h。暫養水溫(18 ± 0.2)℃,鹽度23,溶解氧含量7 mg·L?1,暫養期間不投喂。
隨機選取體質良好的石斑魚60尾,每組20尾隨機放入3個100 cm × 80 cm × 70 cm養殖箱,進行低氧脅迫實驗。參照一般魚類缺氧臨界值(4.0 mg·L?1)及休眠狀態下石斑魚在預實驗中的窒息點(0.17 ± 0.02)mg·L?1,設置溶解(1.74 ± 0.21)mg·L?1的低氧水平。參考朱乾峰等[8]的降溫模式,誘導石斑魚進入休眠狀態,通過覆蓋薄膜和往水中通入氮氣,1 h內將水體溶解氧質量濃度降至(1.74 ± 0.21)mg·L?1,保持水溫15℃,靜態模擬石斑魚保活運輸過程,進行為期72 h的低氧脅迫實驗。每30 min 根據HJ 506-2009,用SG68便攜式多參數測試儀監測水體溶解氧變化,通過調節通入氮氣和空氣的量穩定實驗所需的溶解氧含量。
在低氧脅迫前(0 h)以及脅迫6、12、24、48、72 h時每平行組隨機抽取魚3尾。將石斑魚快速取出,于裝有200 mg·L-1間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)海水的塑料箱中快速麻醉,用蒸餾水沖洗魚體表面黏液和殘留的麻醉劑,用紗布擦干體表,用10 mL一次性無菌注射器進行尾靜脈采血,置4 ℃冰箱靜置2 h,以4 ℃、3 000 r·min-1離心20 min,取血清,分裝,放入- 80℃冰箱保存。采血后剖取魚體肌肉、肝臟和鰓組織,用質量分數0.9%生理鹽水沖洗,用吸水紙吸干水分,置液氮中速凍,于- 80 ℃下保存待測。取肌肉、肝臟、鰓各1.0 g,剪碎,加入9倍 [質量(g) 體積比(mL) ] 的預冷生理鹽水,在冰水浴中勻漿,離心(4 ℃、3 000 r·min-1、10 min),取上清液,測定相關指標。
血清指標包括血糖和血清皮質醇,分別用上海榮盛生物藥業有限公司和江蘇澤雨生物科技有限公司的相應試劑盒按說明書測定。肌肉、肝臟、鰓組織中氧化應激指標包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性、還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)。能量代謝指標包括肌肉和肝臟中糖原(Gn)含量和乳酸脫氫酶(LDH)活性。以上試劑盒購于南京建成生物工程研究所,具體檢測方法按照試劑盒說明書進行。
利用JMP Pro 14.0統計分析軟件對實驗數據進行單因素方差分析,運用Tukey-kramer HSD進行顯著性檢驗,以< 0.05作為差異顯著的標準。實驗數據用平均數± 標準差表示。
圖1可見,在低氧脅迫下,珍珠龍膽石斑魚血清中血糖含量主要呈先升高后下降的變化趨勢,在脅迫6 h時,血糖含量最高,是脅迫前的2.74倍,隨著脅迫時間增長,在72 h時,血糖濃度逐漸下降至脅迫前水平(> 0.05)。

數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)
圖2可見,在低氧脅迫過程中,血清皮質醇含量主要呈上升-下降-上升的波動變化趨勢,但脅迫過程中皮質醇含量均顯著高于脅迫前(< 0.05),在脅迫6 h時血清皮質醇的平均含量最高,是脅迫前的1.44倍。
圖3表明,隨著低氧脅迫時間的增加,珍珠龍膽石斑魚肌肉SOD活性呈增加趨勢,且均顯著高于脅迫前水平(< 0.05);肝臟SOD活性隨脅迫時間的持續先上升后下降趨勢,脅迫6 h時平均值最大,72 h時仍保持較高水平,顯著高于脅迫前(< 0.05),是脅迫前的14.19倍;鰓SOD活性在低氧脅迫6 h時顯著高于脅迫前(< 0.05),之后持續保持較高水平。

數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)

同組織數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)
圖4表明,低氧脅迫6 h時肌肉CAT活性與脅迫前差異不顯著(> 0.05),在脅迫12 h時,CAT活性顯著增加達到最大值(< 0.05),在脅迫24、48、72 h時,CAT活性有所下降,但仍顯著高于脅迫前(< 0.05);肝臟CAT活性在脅迫6 h平均值最高,是脅迫前的1.39倍(< 0.05),隨后降低,在72 h時恢復到脅迫前水平(> 0.05);鰓CAT活性在脅迫12 h、72 h時顯著低于脅迫前(< 0.05),在其余時間點與脅迫前差異不顯著(> 0.05)。

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圖5可見,肌肉MDA含量隨脅迫時間的持續總體上呈增加趨勢,在脅迫12 h時,肌肉MDA含量與脅迫前差異顯著(< 0.05);肝臟MDA含量呈先升后降趨勢,在脅迫6 h時最高(< 0.05),之后持續保持較高水平;鰓組織中MDA含量在脅迫6、12、24 h時顯著低于脅迫前(< 0.05),48、72 h時MDA含量迅速增加,顯著高于脅迫前(< 0.05)。

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圖6表明,低氧脅迫下,肌肉GSH含量在脅迫6、24、48、72 h時顯著低于脅迫前(< 0.05),在脅迫12 h時最大,顯著高于脅迫前(< 0.05),是脅迫前的1.25倍;肝臟GSH含量隨著脅迫時間的延長,呈先增加后減少的趨勢,脅迫72 h后,GSH含量顯著減少(< 0.05),是脅迫前的0.23倍;鰓GSH含量在脅迫6 h時與脅迫前差異不顯著(> 0.05),之后隨脅迫時間的持續,GSH含量持續增加,各組與脅迫前差異顯著(< 0.05)。

同組織數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)
圖7表明,隨著脅迫時間的持續,肌肉總抗氧化能力總體上緩慢增加,在72 h時T-AOC活性最大,與脅迫前差異顯著(< 0.05);肝臟T-AOC活性在48 h時和脅迫前差異不顯著(> 0.05),其余各組均顯著高于脅迫前(< 0.05);鰓T-AOC活性在6、12、48 h時和脅迫前差異不顯著(> 0.05),在24 h時顯著低于脅迫前(< 0.05),在72 h時達到最大值,顯著高于脅迫前(< 0.05)。
圖8可見,隨著脅迫時間的延長,肌肉和肝臟中糖原含量總體上呈降低趨勢(< 0.05),在脅迫72 h時肌糖原和肝糖原分別為脅迫前0.05、0.12倍。圖9表明,肌肉LDH活性隨著脅迫時間的持續,總體上呈增加的趨勢,且各組均顯著高于脅迫前(< 0.05);肝臟LDH活性,在脅迫6 h時,顯著低于脅迫前(< 0.05),隨著低氧脅迫時間的持續,LDH活性不斷增加,在72 h時達到最大值(< 0.05)。

同組織數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)

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Fig. 8 Effects of hypoxia stress on glycogen content in muscle and liver of

同組織數據間凡含一個相同字母則兩者差異不顯著(P > 0.05)
Fig. 9 Effects of hypoxia stress on lactate dehydrogenase activity in muscle and liver of
血糖是重要的能量供給物質,魚體血糖值維持在一定范圍內,才能維持正常的生命活動。血糖的含量受胰島素和腎上腺素等激素及機體其他調節,極易受外界因子刺激而發生波動[2,9]。皮質醇和血糖常用作反映魚體應激的指示性指標,當魚體受到刺激產生應激時,會引起體內各項激素水平的變化,皮質醇為應激反應系統分泌的最后一種激素,隨著應激強度的增大而分泌量增加[10]。
本研究中,珍珠龍膽石斑魚在低氧脅迫6 h時,血清中血糖和皮質醇的含量顯著上升,表明魚體在低氧環境下對缺氧產生應激反應,機體通過激素調節,分泌皮質醇刺激糖的合成、脂肪的分解和糖原的分解,引起血糖濃度升高,同時產生大量能量,以滿足魚體自身的能量需求。這與尼羅羅非魚()[11]、軍曹魚()[12]和大西洋鮭()[13]的結果類似。但隨著脅迫時間的持續和饑餓的作用下,血糖含量降低,在低氧脅迫72 h時恢復到脅迫前水平,而皮質醇的含量持續保持在較高的水平,說明魚體在低氧脅迫過程中一直處于應激狀態,機體組織持續缺氧,無氧呼吸增強,大量消耗葡萄糖,同時皮質醇持續分泌,提供大量能量,滿足各組織對能量的需求,這與團頭魴()的結果類似[14],表明珍珠龍膽石斑魚可通過增強對葡萄糖等消耗利用,緩解缺氧應激對機體造成的損傷。
當珍珠龍膽石斑魚受到脅迫時,其體內活性氧(ROS)含量急劇增加,而過量的ROS會促進細胞膜脂質過氧化,從而對機體造成氧化損傷[15]。機體抗氧化系統由酶促系統和非酶促系統組成。酶促系統包括SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶[16],可清除體內過量ROS和由ROS產生的超氧陰離子自由基(O2-),減緩對機體的氧化損害[12,17]。非酶促系統主要包括MDA、GSH等氧化產物和其他非酶類抗氧化劑[18]。
肌肉控制著魚體的運動,肝臟是魚體主要的代謝中心,鰓是魚體重要的呼吸器官,有研究表明不同的組織在應對低氧脅迫時的能力不同[19],測定不同組織中抗氧化酶活性的變化,能體現各組織抗氧化能力的強弱以及在脅迫中受損程度。本研究中,暫無對血清抗氧化指標變化的研究,略有不足,這將作為日后進一步研究的方向。
本研究中,在低氧脅迫后,珍珠龍膽石斑魚各組織SOD活性顯著高于脅迫前,各組織T-AOC活性在脅迫過程中呈波動性變化,脅迫72 h時最大,說明在脅迫過程中,機體持續受到氧化損傷,刺激機體的抗氧化系統,各組織SOD和T-AOC響應性增高,保護組織不受氧化損傷。這與泥蟹 () 在(3.0 ± 0.2)mg/L的中度缺氧環境下脅迫24 h后鰓組織SOD和T-AOC活性顯著高于脅迫前的結果相似[20]。CAT可將SOD消除ROS、O2-而產生的H2O2轉化為H2O,保護機體細胞內環境的穩定[2]。本研究中,肌肉CAT活性呈先增加后略有回落的趨勢,可能因為肌肉SOD活性不斷增強,產生過多H2O2,刺激CAT的活性顯著升高。而在肝臟中,CAT活性隨著脅迫時間的延長先升后降,逐漸恢復到脅迫前水平,可能與肝臟中抗氧化酶類體系比較活躍,清除ROS的能力較強有關。這與黃顙魚()在低氧脅迫后,血清CAT活性顯著增加,但隨脅迫時間延長活性逐漸下降的結果類似[21]。脅迫72 h后,鰓組織中CAT活性顯著低于脅迫前,表明隨著脅迫時間的延長,鰓組織受到的氧化應激加劇,鰓組織中抗氧化物質合成能力下降,氧化—抗氧化失衡,導致鰓組織中CAT活性顯著下降[12]。
MDA屬于脂質過氧化物,反映機體的氧化損傷程度[22]。本研究中,肝臟MDA含量在脅迫后均顯著高于脅迫前,肌肉MDA含量在脅迫12 h后顯著高于脅迫前,說明魚體在低氧脅迫過程中,肌肉和肝臟氧化損傷程度不斷加重,使細胞脂質過氧化反應加劇,導致MDA大量生成,而鰓組織MDA含量在脅迫初中期顯著低于脅迫前,這可能是在缺氧環境下,珍珠龍膽石斑魚有氧呼吸受抑制,氧氣經過線粒體呼吸鏈減少,線粒體產生的ROS相應減少,鰓組織細胞受到的氧化損傷相應減少[23],與瓦氏黃顙魚()[24]的結果相似。GSH是有重要解毒功能的非酶抗氧化劑,可消除體內自由基[19]。本研究中,在低氧脅迫下,肌肉和肝臟GSH含量分別在12 h和6 h時最大,之后隨著時間的延長不斷降低,在72 h時顯著低于對照水平,說明在脅迫過程中,肌肉和肝臟通過合成和轉化產生大量的GSH,配合組織中的抗氧化酶清除ROS,后期GSH的含量減少,可能與組織受到的氧化損傷得到緩解有關[18];鰓組織GSH含量不斷增加,說明鰓組織中ROS積累程度不斷加深,需更多的GSH消除ROS,與翹嘴鱖()[25]結果類似。說明鰓組織相比肌肉和肝臟,更易受到低氧脅迫的影響。
糖原是機體維持正常生命活動的主要能源物質[6]。糖原含量降低,糖酵解活性增加,表明糖代謝在魚類應對急性缺氧應激起重要的能量供應作用,當水體溶解氧不能滿足有氧糖酵解的需氧量時,需要依靠厭氧糖酵解產生能量滿足缺氧應激期間魚體的能量需求[26]。LDH可催化丙酮酸和乳酸之間的轉化,參與糖的無氧酵解和糖異生作用,為生命活動提供能量,其活性大小在一定程度上可反映無氧呼吸的強弱和魚體耐受低氧的能力[27]。本研究中,在低氧脅迫下,肌肉和肝臟糖原含量隨脅迫時間的延長而不斷下降,LDH活性總體上隨脅迫時間的延長而增加,說明肌肉和肝臟組織缺氧情況加劇,有氧呼吸供能不足,無氧呼吸增強,分解肌糖原和肝糖原,滿足機體正常的能量代謝,這與軍曹魚[23]和尼羅羅非魚[26]在急性低氧脅迫后,肝臟和肌肉糖原含量急劇下降,LDH含量急劇上升的結果類似。同時低氧環境下誘導LDH活性增強,LDH可通過催化乳酸轉化為丙酮酸,減少肌肉和肝臟中乳酸的積累,以保護組織免于缺氧損傷。
低氧脅迫對珍珠龍膽石斑魚生理代謝產生顯著影響,激活魚體內抗氧化系統,增強氧化應激防御機制,通過激素調節和加強無氧呼吸供能,保障機體擁有充足的能量來適應缺氧環境下生理代謝的變化。在缺氧過程中,珍珠龍膽石斑魚不同組織應對缺氧帶來的氧化壓力能力不同,肝臟氧化防御體系較發達,鰓組織受損情況較為嚴重。
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Effects of Hypoxic Stress on Antioxidant and Energy Metabolism of Hybrid Grouper (♀×♂)
LU Ze-feng, HUANG He, HUANG Xiang-mei, HUANG Wei-zhen
(,,524088,)
【Objective】To explore the effects of hypoxia stress on oxidative stress of hybrid grouper () during actual survival transportation. 【Methods】Hybrid groupers[(498.2 ± 27.3)g] were induced to enter a dormancy state and placed in hypoxic environment with the dissolved oxygen content of (1.74 ± 0.21) mg·L?1. After 0, 6, 12, 24, 48 and 72 h of hypoxic stress, serum stress index, oxidative stress index of muscle, liver and gill and energy utilization index of the muscle and liver were measured. 【Result】Under hypoxia stress, the serum blood glucose content reached the maximum at 6 hand recovered to the pre-stressed level at 72 h. The cortisol level during stress was significantly higher than that of the before stress. Superoxide dismutase (SOD) activity in the muscle increased with stress time, while SOD activity in the liver and gill increased initially and then decreased. Catalase (CAT) activity in the muscle and liver increased firstly and then decreased, and CAT activity in gill was significantly lower than before stress for 12 and 72 h. Malondialdehyde (MDA) content increased in muscle and liver, but decreased first and then increased in the gill. The content of glutathione reductase (GSH) in muscle reached the maximum value at 12 h, the content of GSH in liver increased firstly and then decreased, and the content of GSH in gills was significantly higher than before stress at 72 h. The total antioxidant capacity (T-AOC) increased in the muscle, liver and gill. Glycogen content in the muscle and liver was significantly reduced and lactate dehydrogenase activity significantly increased. The significance levels used in all tests were< 0.05. 【Conclusion】The results showed that hypoxic stress can stimulate the stress response of hybrid grouper (), affect the normal oxidative stress system, and cause different degrees of oxidative damage to different tissues.
; hypoxia stress; oxidative stress;energy metabolism
S981.16
A
1673-9159(2022)01-0013-07
10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.003
陸澤峰,黃和,黃湘湄,等. 低氧脅迫對珍珠龍膽石斑魚氧化應激及能量代謝的影響[J]. 廣東海洋大學學報,2022,42(1):13-19.
2021-09-04
“十三五”國家重點研發計劃重點專項(2019YFD0901605)
陸澤峰(1997―),男,碩士研究生,研究方向為水產品貯藏與加工。E-mail:luzefeng2021@163.com
黃和(1962―),男,教授,研究方向為水產品質量安全研究。E-mail: zjhahe@163.com
(責任編輯:劉慶穎)