鳥巢蕨孢子體試管外誘導與移栽基質篩選

杜高齊，孟 靜，胡本湘，何 俊，許 彬

（1. 云南農業大學園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201）

鳥巢蕨（Asplenium nidus），又名巢蕨、山蘇花、王冠蕨，為鐵角蕨科巢蕨屬多年生常綠蕨類植物[1]，株形奇特，葉色翠綠有光澤，是優良的園林景觀植物、室內盆栽植物、插花葉材料，市場需求很大[2]，有研究顯示其食用和藥用價值也很高[3]。

孢子繁殖是蕨類植物繁殖的重要方式[4]，具有取材少、繁殖系數大、成苗量大、擴繁快速的優點。然而，不同種蕨類植物的孢子繁殖具有一定差異，在現實生產中難以一一掌握所有種類的孢子繁殖規律，因此這種繁殖方式不利于資源蕨類植物的高效率開發應用。而原葉體誘導孢子體是蕨類植物繁殖的有效方 式[5]，對于一些無孢子或孢子量少、孢子不育的雜交種以及孢子繁殖困難的種類尤為適宜[6]。原葉體誘導孢子體主要有試管內和試管外2種誘導方式，但是試管內誘導孢子體較難，幾乎無孢子體產生。試管外誘導孢子體的研究中發現，不同誘導劑的誘導效果不同，1 g/L KH2PO4的誘導效果最佳[7-8]。

基質主要通過營養供給、通氣狀況等影響蕨類植物的孢子萌發、配子體和孢子體的生長發育[9]。試管外誘導蕨類植物孢子體的基質要求疏松透氣、保水保肥、不含有害物和雜草種子。王陽[5]發現在常規條件下以對開蕨0.5 cm原葉體進行孢子體誘導試驗，草炭是最適誘導基質。趙玉安等[10]的研究表明，草炭與珍珠巖按體積比3∶1混合制成的基質最適宜鳥巢蕨孢子體誘導。移栽基質對鳥巢蕨孢子體種苗質量有很較大影響。吳士彬等[11]的研究顯示，鳥巢蕨孢子體的最適移栽基質為草炭、珍珠巖、蛭石按體積比3∶1∶1混合。

試驗以鳥巢蕨組培原葉體為材料，研究不同直徑大小的原葉體塊以及不同基質對鳥巢蕨試管外孢子體誘導的影響，并對移栽基質進行了篩選，旨在為鳥巢蕨工廠化育苗提供理論和技術支持，為其商業化、規模化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以經鳥巢蕨孢子無菌萌發、組織培養得到的原葉體為試驗材料，于2018年11月至2019年3月在實驗室和大棚中進行孢子體誘導及栽培試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同大小原葉體塊誘導孢子體為探討原葉體塊大小對孢子體誘導效果的影響，根據原葉體切割直徑大小設3個處理（分別為2.0、1.0、0.5 cm），將原葉體塊插入以草炭為基質的9 cm培養皿中；每個處理重復6次，原葉體直徑2.0 cm的處理每個培養皿種植5塊，共30塊；直徑1.0 cm的處理種10塊，共60塊；直徑0.5 cm的處理種20塊，共120塊；放入人工氣候箱中培養，濕度保持在80%以上，溫度保持在25℃，每2 d噴一次1 g/L KH2PO4。當分化出孢子體時開始計數，每隔5 d統計一次誘導情況，40 d后培養結束，統計孢子體誘導及壞死情況。

1.2.2 孢子體試管外誘導基質篩選孢子體誘導基質配方設置7個處理，分別為：A1，草炭；A2，珍珠巖、椰糠按1∶1比例（體積比，下同）混合；A3 ，椰糠；A4，蛭石；A5，草炭、珍珠巖按1∶1比例混合；A6，草炭、蛭石按1∶1比例混合；A7，河沙。基質用0.5 g/L的多菌靈溶液浸透消毒處理后備用。將原葉體洗凈切成1.0 cm的小塊，放入裝有基質的9 cm培養皿中培養，每個培養皿中放10塊，每個處理重復5次，培養條件同上。當分化出孢子體時開始計數，每隔5 d統計一次誘導情況，40 d后培養結束，統計孢子體誘導及壞死情況，按公式（1）、（2）計算孢子體誘導率、壞死率。

1.2.3 移栽基質篩選孢子體移栽基質配方設置5個處理，分別為：B1，椰糠；B2，珍珠巖、草炭按1∶1比例混合；B3，草炭；B4，珍珠巖、椰糠 按1∶1比例混合；B5，草炭、蛭石、珍珠巖按2∶1∶1的比例混合。將誘導出孢子體的原葉體塊取出放入溫室中，5 d后移栽入消毒后的基質（消毒處理同上）。移栽時將孢子體植株從原葉體上分離，洗凈，栽入帶有基質的24孔穴盤中，放入育苗箱中保濕培養，30 d后統計成活率；每個處理栽植10株，每個處理重復5次。成活后每個處理隨機選取10株測量孢子體株高、葉片數、平均葉面積（每株取最大葉片測面積）、冠幅（植株長×植株寬），每隔5 d統計一次，60 d培養結束。

1.3 數據分析處理

試驗參考王春榮等[12]方法，根據葉片數、株高、冠幅、葉面積、成活率5個指標在不同基質中的表現將鳥巢蕨各項指標排序，各項指標的影響均設定為1，按排序進行打分，規定第一名5分，第二名4分，依次類推，最后一名1分，再計算各處理總分值，進行綜合評判，得分最高的基質為最適基質配比。試驗數據采用Excel 2016軟件和DPS 7.05數據處理系統進行處理。

2 結果與分析

2.1 原葉體塊直徑對鳥巢蕨孢子體誘導的影響

培養40 d后，不同直徑原葉體塊誘導的鳥巢蕨孢子體株數及壞死率如圖1所示，孢子體在試管外誘導時，3種直徑的原葉體塊均能誘導出孢子體，隨著原葉體塊直徑的增加，誘導效果顯著提升，但壞死率也隨之增加；直徑為2.0 cm的原葉體塊孢子體誘導株數最多，為106株，分別是直徑0.5、1.0 cm原葉體塊誘導株數的4.8、2.4倍；壞死率也最高，達到13.3%，分別比直徑0.5、1.0 cm原葉體塊壞死率高10.8、3.3個百分點。

圖1 不同直徑原葉體誘導的鳥巢蕨孢子體株數及壞死率

2.2 鳥巢蕨試管外孢子體誘導的最佳基質

由表1可知，不同基質誘導鳥巢蕨孢子體的效果差異較大，各處理孢子體誘導率大小趨勢為A1＞A5＞ A6＞A2＞A7＞A3＞A4。原葉體壞死率最高的基質是A4，其次為A7；A1和A5沒有壞死情況發生。綜合誘導率和壞死率結果，認為草炭（A1）為鳥巢蕨孢子體誘導的最佳基質。

表1 不同基質下鳥巢蕨孢子體的誘導情況

2.3 鳥巢蕨孢子體移栽的最佳基質

如表2所示，鳥巢蕨孢子體移栽60 d后不同移栽基質中植株生長情況有較大差異。各處理成活率由高到低排列依次為B2＞B1=B3＞B4＞B5。其中，B2處理成活率最高，達到100 %，B5處理最低，為83.30%。不同基質對鳥巢蕨生長產生的影響不同，與其他處理相比，B2處理除葉片數少于B1處理外，其他4項指標均為最大值，且與其他處理差異顯著。由表3可知，各處理綜合排序依次為B2＞B1＞B3＞B4＞B5，其中B2處理綜合排序第一，可見B2是最適合鳥巢蕨孢子體移栽的基質配方。

表2 不同栽培基質下鳥巢蕨的生長情況

表3 不同栽培基質下各項指標得分情況及綜合排序

3 討論與結論

蕨類植物原葉體發育形成孢子體的概率較低，曾漢元[13]對24種蕨類植物進行孢子體誘導試驗發現，原葉體發育形成孢子體的誘導率為10%~70%。該試驗使用鳥巢蕨原葉體誘導孢子體，誘導率與上述結果基本一致，平均誘導率為46%，但少有人研究原葉體直徑對孢子體誘導的影響。張善信等[14]將鳥巢蕨原葉體團切割成0.5 cm直徑的團塊進行孢子體誘導；潘曉韻等[15]將鳥巢蕨原葉體切成0.5~1.0 cm的小塊作為材料；劉洋[8]采用0.5 cm的鳥巢蕨原葉體團進行孢子體誘導；劉聞川等[16]采用1.0 cm的槲蕨小段為材料進行孢子體誘導；望雄英[17]則是以直徑1.0 cm的荷葉鐵線蕨原葉體團為材料。而在該試驗中，筆者將原葉體塊分為2.0、1.0、0.5 cm 3種直徑大小，探討其對孢子體誘導的影響，結果發現大塊原葉體（2.0 cm）更有利于孢子體誘導。

前人對孢子體誘導基質也進行了相關的研究，顧德峰等[7]選用草炭作為對開蕨孢子體誘導基質；望雄英[17]發現泥炭與珍珠巖按6∶1比例混合制成的基質中荷葉鐵線蕨孢子體誘導率最高，而該試驗對7種不同的孢子體誘導基質進行篩選，結果表明，草炭是最佳的鳥巢蕨孢子體誘導基質，誘導率最高為70.00 %，這與趙玉安等[10]報道的基本一致，分析其原因是草炭不僅可以提供孢子萌發所需要的營養物質，也能夠為孢子萌發的環境提供充足的水分，同時也與原葉體直徑越大越有利于孢子體誘導有關。

蕨類植物需要良好的基質為其提供足夠的養分、水分和支撐力，不同基質的物理化學性質不同，因此選對基質是栽培成功的關鍵。前人對鳥巢蕨栽培基質進行一系列的研究。例如：許澤康等[2]對經過馴化的野生鳥巢蕨植株進行移栽基質篩選，發現椰糠是最適合鳥巢蕨人工栽培的基質；陳金典[18]研究發現，鳥巢蕨組培苗的最適移栽基質為草炭、珍珠巖與蛭石按3∶1∶1的比例混合或者鋸木屑、草炭與紅心土按1∶1∶1的比例混合。筆者設計了5種移栽基質，最后發現，草炭與珍珠巖按1∶1比例混合而成的基質綜合排序第1，這與與前人的研究結果不同，推測是因為在草炭中加入珍珠巖之后，改變了草炭的孔隙結構，增強了透氣性，給鳥巢蕨孢子體提供了更適合的生長環境。

綜上所述，原葉體塊的直徑對孢子體誘導的影響較大，大塊原葉體（直徑2.0 cm）最有利于孢子體誘導；鳥巢蕨孢子體試管外誘導的最佳基質為草炭，誘導率最高，達70.00%，無壞死情況發生；最適合鳥巢蕨孢子體移栽的基質是珍珠巖與草炭按體積比1∶1混合而成的基質，其成活率、冠幅、株高、葉面積方面均在所有處理中最高。該研究結果可為鳥巢蕨商業化生產提供技術支撐。