沙利度胺對人宮頸癌Hela細胞周期的影響探討

劉 恒

（沈陽市第九人民醫院，遼寧 沈陽 110020）

宮頸癌是現代女性群體發生率較高的一種惡性腫瘤，人乳頭狀瘤（HPV）感染是誘發宮頸癌的主要原因，宮頸癌具有惡性程度高、臨床預后差等特征[1-3]。Hela細胞是由人宮頸癌組織分離出的細胞株，Hela細胞增殖、凋亡與腫瘤預后密切相關，且已有研究表明[4]，宮頸癌的高侵襲性和Hela細胞高度表達有關侵襲因子存在相關性。THD是一種非巴比妥類藥物，其作用機制是抑制血管生成及抗凋亡、抑制單核細胞產生TNF-α等，當下本品藥物在黑色素瘤、結腸癌等領域中均有應用，在抗腫瘤生成過程中發揮良好效能[5]。本次研究使用不同程度的THD對人宮頸癌進行干預，探究其對Hela細胞周期形成的影響，具體如下。

1 材料與方法

1.1 使用的材料 本試驗內人宮頸癌細胞株Hela細胞均從中國科學院細胞庫提取，選擇Gibco公司生產的RPMI-1640培養基，THD由Selleck公司購進，CCK-8試劑的提供單位是Sigma公司，p53與p-p53由Cell Signaling Technology公司提供，試劑盒購自杭州聯科生物公司[6]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Hela細胞置入RPMI-1640培養液內（含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素），在恒定（37 ℃，5% CO2）培養箱內培養。提取雙數生長期Hela細胞，經胰酶消化處理后放到含有血清培養基上終止消化進程。然后進行離心處理（3500 r/min的速率離心5 min），去除上清液，加入適量新鮮培養液重懸細胞沉淀以進行傳代培養[7]。

1.2.2 試驗分組 采用DMSO將深度為20 mg/mL的沙利度胺溶液進行溶解。使用培養基將THD分別稀釋到50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL，處理Hela細胞時分為空白組（0 μg/mL THD）、低濃度組（50 μg/mL THD）、中濃度組（100 μg/mL THD）、高濃度組（200 μg/mL THD）。

1.2.3 細胞活力 采用CCK-8法檢測，具體是把雙數生長期的Hela細胞勻稱的接種至96孔板中，將細胞密度設為5×105/孔，同時創設6個重復孔。繼而把細胞放置在37 ℃，5%CO2培養箱內培養。待觀察到細胞貼壁以后，使用不同濃度THD持續處理Hela細胞24 h，繼而將5 μL CCK-試劑置入每個空洞中，置入培養箱內繼續培養，當波長達到450 nm時應用酶標儀檢測細胞吸光度值。實施MTT試驗：每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續培養4 h后終止培養，吸去孔內培養液，在酶聯免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，每組重復4次，求其平均值，對兩組測定值。

1.2.4 細胞周期分布 采用流式細胞術檢測，具體操作過程中把雙數生長期的Hela細胞勻稱接種至6孔板內，設定細胞對應的密度為3×105/孔。待觀察到細胞貼壁后，把THD加入至Hela細胞內。歷經24 h后，采集2×105～1×106個細胞，采用1 000×g離心處理5 min。去除上清液后將預冷的無水乙醇（約3 mL）緩緩加入，混勻。離心去除乙醇后加入PBS溶液（2 mL），在室溫條件靜置15 min使細胞水化，經離心后除去上清液，加入的DNA staining solution 1 mL后再充分混勻，避光孵育30 min后，采用流式細胞儀進行檢測[8]。

1.2.5 蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法檢測蛋白表達水平，操作方法為：先在6 cm培養皿內把雙數生長期的細胞均勻的進行接種，設細胞接種對應的密度為1×106。待觀察到細胞貼壁后，加入適量THD溶液作用24 h。繼而采用細胞裂解液提取細胞蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測算每組蛋白對應的濃度。待膠和濃縮膠配制結束后對其行分離措施，進行凝膠電泳，繼而利用濕轉法轉膜（250 mA，120 min）。采用含5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。封閉完成，在恒溫條4 ℃搖床上用抗稀釋液（p-p53/p53）處理，1∶1 000過夜孵育PVDF膜，用TBST連續對PVDF膜進行3次洗滌，每次持續10 min，最后采用成像儀對PVDF膜進行顯影，并分析灰度值[9]。

1.3 統計學方法 本組試驗內所有信息資料均使用SPSS26.0軟件對數據進行處理，用（%）表示計數等資料，χ2或Fisher確切概率法計算。檢驗水準為α=0.05，以（）表示細胞增殖程度等計量資料，t檢驗；當P＜0.05，表示數據內差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THD對人宮頸癌Hela細胞增殖形成抑制作用 CCK-8檢測結果表明，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD處理人宮頸癌Hela細胞24 h，能夠劑量依賴性的降低Hela細胞活力（P＜0.05），這提示THD對人宮頸癌Hela細胞增殖過程有明顯的抑制作用。見圖1。

圖1 不同濃度THD對Hela細胞活力形成的影響

2.2 MTT法測定小鼠胚胎成骨細胞增殖程度結果比較 MTT法測定人宮頸癌Hela細胞增殖程度顯示，490 nm處空白組（0 μg/mL THD）吸光值為（0.679±0.098），低濃度組（50 μg/mL THD）吸光值為（0.575±0.089）、中濃度組（100 μg/mL THD）吸光值為（0.418±0.242）、高濃度組（200μg/mL THD）吸光值為（0.242±0.089）。低濃度組、中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于空白組，差異有統計學意義（t＝4.426，P＜0.05；t＝5.891，P＜0.05；t＝6.023，P＜0.05）。中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于低濃度組，差異有統計學意義（t＝3.456，P＜0.05；t＝4.091，P＜0.05）。高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于中濃度組，差異有統計學意義（t＝3.456，P＜0.05）。見表1。

表1 MTT法測定人宮頸癌Hela細胞增殖程度（）

表1 MTT法測定人宮頸癌Hela細胞增殖程度（）

2.3 THD能抑制人宮頸癌Hela細胞周期G1/S轉換 在腫瘤發生發展過程中，細胞周期異常扮演著重要角色。在本次研究中，流式細胞術檢測結果表明，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制細胞作用，抑制增殖程度與THD呈正相關，（P＜0.05），且S期細胞顯著減少（P＜0.05）。這表明THD對Hela細胞細胞周期G1/S轉換過程能形成較明顯的阻滯作用，見圖2。

圖2 不同濃度THD對Hela細胞周期分布形成的影響

2.4 THD對Hela細胞其中p53蛋白的活化具有抑制作用 p53為一種抑制腫瘤的蛋白，能誘導細胞周期阻滯。我們在長期的試驗研究中認為，THD對人宮頸癌Hela細胞周期的抑制作用可能和其對p53活化能形成較明顯的調控作用相關。結果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD連續處理Hela細胞24 h后，p-p53/p53比值明顯上升（P＜0.05），這提示THD可能是通過促進p53活化過程，實現抑制人宮頸癌細胞周期。

3 討論

宮頸癌是婦科中發病率較高的一種惡性腫瘤，發病率、病死率較高是本病的主要特征，且最近幾年中，本病患病群體有年輕化趨勢，對廣大女性的健康與生命安全構成嚴重威脅[10]。宮頸癌的發生發展和HPV感染、血管增生、MMP有關通路激活均存在明顯的相關性。最近幾年中，國內外許多試驗研究表明[11-12]，對于宮頸癌患者均伴有HPV感染，HPV感染以其轉錄產物為媒介，介導VEGF、EGFR等的表達。有學者研究表明，腫瘤的MMPs信號通路活化水平與宮頸癌患者預后有關。

從宮頸癌組織內分離出一種細胞株就是Hela細胞，Hela細胞的行為狀態能體現出宮頸癌惡化程度，而惡性腫瘤的生物學行為以細胞無限制性增殖與浸潤為主[13]。Hela細胞增殖、浸潤及凋亡行為，均有益于拓展臨床醫師對生物學行為理解的深度性。THD作用較為廣泛，其最早被應用在骨髓瘤治療領域中。既往有學者指出[14-16]，THD抗腫瘤的抑制機制可能是抑制腫瘤血管形成和產生免疫抑制，其還可以用于其他癌癥的領域當中，如肝癌、結腸癌等。還有研究表明，THD對G1期阻滯過程能形成明顯的抑制作用，阻斷DNA合成并抑制腫瘤細胞增殖過程。以上均提示THD的抗腫瘤作用可能和其抑制腫瘤細胞增殖過程存在相關。在本次研究中，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD進行24 h持續處理，對Hela細胞活力能產生明顯降低（P＜0.05），說明THD能抑制Hela細胞增殖過程。采用MTT法測定人宮頸癌Hela細胞增殖程度變化也顯示，THD可有效降低人宮頸癌Hela細胞增殖程度，490 nm處空白組（0 μg/mL THD）吸光值為（0.679±0.098），而低濃度組（50 μg/mL THD）吸光值為（0.575±0.089）、中濃度組（100 μg/mL THD）吸光值為（0.418±0.242）、高濃度組（200μg/mLTHD）吸光值為（0.242±0.089）；低濃度組、中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于空白組（P＜0.05），且中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于低濃度組（P＜0.05），而高濃度組人宮頸癌Hela細胞增殖程度均顯著高于中濃度組（P＜0.05），可知低、中、高濃度THD均可抑制人宮頸癌Hela細胞增殖程度，隨THD濃度升高，人宮頸癌Hela細胞增殖程度逐漸降低，高濃度THD抑制增殖效果更佳，提示THD抑制增殖效果呈劑量依賴性，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制作用，可為宮頸癌的臨床治療提供一定參考依據。

細胞周期異常和腫瘤發生發展過程中存在密切相關，現代醫學研究中最新突破表明：靶向細胞信號傳輸渠道為載體調節細胞周期。在生物學中，可以將細胞周期細化為5個階段[17]：G0（靜息期）、G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期）與M（有絲分裂期），其中G1/S與G2/M是監測細胞組分完整性與DNA合成真實度的重要檢查位點。在本次研究結果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD連續處理Hela細胞24 h后，p-p53/p53比值明顯上升（P＜0.05），這提示THD可能是通過促進p53活化過程，實現抑制人宮頸癌細胞周期；50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL THD持續處理Hela細胞24 h后，Hela細胞G0/G1期細胞數目增加顯著，S期細胞顯著減少（P＜0.05）。這表明THD可以抑制Hela細胞細胞周期G1朝向S轉換過程，提示THD對人宮頸癌Hela細胞周期的抑制作用可能和其對p53活化能形成較明顯的調控作用相關。

p53可以被視為基因組的“監護人”，在多種刺激因素作用下能調控細胞增殖過程，如DNA損傷與超聲致癌信號均能激活p53腫瘤抑制渠道，從而調控上百個基因的轉錄反應[18-20]。因為p53蛋白活化在細胞周期中發揮重要調控作用，故而本次研究中分析了THD對Hela細胞p53活化形成的影響。結果表明，THD能明顯提升p53表達水平，實現對宮頸癌細胞周期的間接性抑制。

綜上所述，可見THD通過提升p53蛋白活性去實現對人宮頸癌Hela細胞周期的有效抑制，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制細胞作用，抑制增殖程度與THD呈正相關性，藥理作用確切，這能為宮頸癌臨床治療提供較可靠的試驗依據，促進患者病情恢復進程。