慢性乙型肝炎患者細(xì)胞毒T細(xì)胞內(nèi)穿孔素、干擾素及白細(xì)胞介素10表達(dá)與病毒消除的關(guān)系

李 劇

（大連市公共衛(wèi)生臨床中心，大連市第六人民醫(yī)院，遼寧 大連 116031）

臨床上，慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。現(xiàn)階段眾多學(xué)者指出，機(jī)體在感染乙型肝炎病毒后，不會對肝臟造成直接損傷，而是與B型流感嗜血桿菌介導(dǎo)的免疫損傷存在密切的聯(lián)系[1]。乙型肝炎病毒感染引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)在消除乙型肝炎病毒中發(fā)揮了十分重要的作用。本次研究以對慢性乙型肝炎患者細(xì)胞毒T細(xì)胞內(nèi)穿孔素、干擾素（IFN-γ）及白細(xì)胞介素10（IL-10）表達(dá)與病毒消除的關(guān)系進(jìn)行研究分析為目的，對收治的慢性乙型肝炎患者展開了CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究中資料來源于我院收治的獲得臨床確診的慢性乙型肝炎患者，共56例作為研究對象，定義為觀察組，包括男32例，女24例，年齡19～54歲，平均（29.8±9.2）歲，HBeAg陽性者29例，HBeAg陰性者27例。取同期健康體檢者56名作為研究對象，包括男29例，女27例，年齡18～56歲，平均（28.7±11.3）歲。兩組上述指標(biāo)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05，存在可比性。病情符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，且自愿參與研究，簽同意書。研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)要求。

1.2 方法 檢測所需儀器為我院現(xiàn)有的FACS Calibur流式細(xì)胞儀，BD Cytofix／Cytoperm試劑盒、Perfofin FITC（異硫氰酸）、CD8-藻紅蛋白（PE）、IFN-γ-FITC、IL-10-FITC及作同型對照的鼠抗人IgGγ1γ2-FITC/PE單克隆抗體，購自美國BD公司；Lightcycler熒光定量PCR分析儀，購自Roche公司，HBV-DNA核酸擴(kuò)增熒光定量檢測試劑盒購自深圳匹基生物工程有限公司，結(jié)果在500拷貝/mL以下，可認(rèn)為陰性[3]。采集受試者晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血液，選用一次性真空管收集，一份經(jīng)肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記檢測，另外一管分離血清，展開HBV-DNA檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 對兩組受試者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。采用熒光定量PCR法對慢性乙型肝炎患者HBV DNA載量進(jìn)行檢測，對病毒載量與CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件處理。計量資料以（）表示，并實施t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，并實施χ2檢驗；P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較對照組發(fā)生顯著降低（P＜0.05）；HBeAg陽性患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較HBeAg陰性患者發(fā)生顯著降低（P＜0.05）；CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10的表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表1～表3。

表1 觀察組與對照組受試者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平比較（%，）

表1 觀察組與對照組受試者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平比較（%，）

表2 觀察組HBeAg陽性與陰性患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較（%，）

表2 觀察組HBeAg陽性與陰性患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較（%，）

表3 觀察組CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平與HBV DNA載量的關(guān)系（）

表3 觀察組CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平與HBV DNA載量的關(guān)系（）

注：a與DNA陰性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；b與低拷貝組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

HBV屬于非細(xì)胞毒性病毒的一種，感染該類病毒，雖然不會使肝細(xì)胞受到直接的損傷，但所發(fā)生的炎性反應(yīng)，是由免疫介導(dǎo)誘發(fā)[4]。既往相關(guān)領(lǐng)域的研究顯示，在HBV感染發(fā)生的初期階段，多克隆、特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)也會隨之產(chǎn)生，在感染病變發(fā)生的慢性期階段，CTL反應(yīng)程度相對低下，甚至完全沒有發(fā)生反應(yīng)[5]。CTL發(fā)揮免疫效應(yīng)的途徑相對較多，通過Fas/FasL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，或利用分泌IFN-γ、TNF的非細(xì)胞裂解途徑等[6]。不充分的CTL反應(yīng)不但會使HBV的慢性期長時間存在，同時還可以促使非特異性T細(xì)胞對肝細(xì)胞所造成的損害。Perforin被稱為成孔蛋白、細(xì)胞溶素、C9相關(guān)蛋白，主要通過激活特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、成熟NK細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，在吞噬細(xì)胞、星形細(xì)胞、骨髓前體細(xì)胞等細(xì)胞中也可出現(xiàn)，具有膜穿孔能力，并可以形成巨大穿膜通道，因此獲得成孔蛋白[7]。

病毒在對人體造成感染后，機(jī)體內(nèi)肝臟消除病毒的途徑較多，主要是非溶細(xì)胞性、溶細(xì)胞性2種，多以非溶細(xì)胞性為主，通過各種細(xì)胞因子的作用[8]。不同臨床類型的乙型肝炎患者，其特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答存在明顯的差異性。有研究證實，慢性乙型肝炎患者中，特異性CTL存在明顯的功能缺陷，產(chǎn)生Perforin、顆粒酶、IFN-γ能力降低，嚴(yán)重時會缺失，在重癥乙型肝炎患者體內(nèi)，Perforin、顆粒酶的表達(dá)水平會發(fā)生顯著增高，與乙型肝炎病毒載量呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)[9-10]。乙型肝炎誘發(fā)的免疫反應(yīng)多經(jīng)T細(xì)胞介導(dǎo)，輔助性T淋巴細(xì)胞分為Th1、Th2 2種主要亞群，其中Th1細(xì)胞分泌干擾素γ、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子，對細(xì)胞免疫產(chǎn)生介導(dǎo)，Th2細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素10等細(xì)胞因子，會對B細(xì)胞增生產(chǎn)生刺激，介導(dǎo)體液免疫[11-12]。在HBV感染后，免疫機(jī)制包括天然免疫、適應(yīng)性免疫，其中適應(yīng)性免疫在慢性乙型感染患者中具有主導(dǎo)作用，特異性CD8＋T淋巴細(xì)胞功能、狀態(tài)對慢性乙型肝炎的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等可產(chǎn)生顯著作用[13-14]。

HBeAg屬于一種免疫耐受因子，可促使Th2樣細(xì)胞因子分泌，使機(jī)體對HBeAg的免疫攻擊反應(yīng)下調(diào)，產(chǎn)生對HBV感染的免疫耐受性，無法消除病毒，從而導(dǎo)致HBV感染發(fā)生慢性化[15-17]。HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者與HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，其在分子病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)以及臨床表現(xiàn)等方面均存在顯著差異。HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者，血清HBeAg水平與CD8＋T細(xì)胞活性之間存在明顯的正相關(guān)[18-20]。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較對照組發(fā)生顯著降低；HBeAg陽性患者CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平較HBeAg陰性患者發(fā)生顯著降低；CD8＋細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10的表達(dá)水平與HIV DNA載量呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果相似[21]。由此證實，慢性乙型肝炎患者細(xì)胞毒T細(xì)胞內(nèi)Perforin、IFN-γ、IL-10表達(dá)水平會發(fā)生顯著減少，并且與慢性乙型肝炎患者病毒長期存在有關(guān)，與病程遷延不愈存在密切聯(lián)系，在今后的臨床診斷和治療中，應(yīng)給予足夠的關(guān)注。