內質網應激蛋白GRP78在腦出血后星形膠質細胞炎性活化中的作用及機制

張春陽 郭振委 何效兵 周芯羽

南京醫科大學連云港臨床醫學院（連云港市第一人民醫院）神經內科（江蘇連云港222002）

自發性腦內出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種嚴重的致死性卒中亞型，占所有卒中患者的10% ～ 15%［1］。炎癥在ICH 引起的腦損傷中起著重要作用［2］。探討炎癥反應在ICH 中的機制有重要意義。星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的細胞，其在腦出血后幾分鐘內被激活，并通過建立最終導致神經變性的前饋炎癥環路在神經炎癥期間發揮神經毒性作用［3］。因此，星形膠質細胞在ICH 的發生發展中起著至關重要的作用，研究其作用機制對ICH 的治療具有重要意義。葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是一種多功能蛋白，主要表達于內質網（endoplas?mic reticulum，ER）內腔［4］。GRP78 作為ER 的主要伴侶和ER 應激信號的主要調節者，通過控制蛋白質折疊和組裝、防止蛋白質聚集來調節未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［5］。目前認為，GRP78 參與多種神經退行性疾病，包括阿爾茨海默病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化和帕金森病等［6］。此外，活化的星形膠質細胞被認為有助于神經退行性變，它們的數量與神經退行性變過程中持續的損傷有關［7］。然而，尚未明確GRP78 是否在星形膠質細胞炎性活化中發揮作用，目前國內關于此類研究較少。因此，本研究建立了ICH小鼠模型和體外LPS 誘導的星形膠質細胞的炎癥模型，探討了GRP78 在星形膠質細胞炎性活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及ICH 模型建立8 周齡雄性CD1 小鼠（體質量約30 ～ 40 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠在手術前至少3 d被飼養在溫度和濕度受控以及12 h光/暗循環的房間中，能自由進食和飲水。參照文獻方法通過自體全血注射誘導ICH［8］。具體操作為：小鼠用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）（2∶1 v/v，腹腔注射）麻醉并俯臥在Kopf立體定向頭架（美國CA公司）。在手術過程中使用人工淚液軟膏（德國海露公司）保持小鼠眼睛濕潤。將動脈血收集在非肝素化毛細管中，立即轉移到250 μL Hamilton 注射器上的27 號針頭中。鉆出一個1 mm 的顱骨鉆孔，并將Hamilton注射器立體定向地插入右側基底神經節（坐標：前囟后0.2 mm，前囟外側2.2 mm 和硬腦膜下方3.5 mm）。使用Stoelting 微型輸液泵（美國Holliston公司）將總體積為30 μL 的血液輸注到右側基底神經節中，并在注射完成后，將針頭留在原位5 min以防止可能的泄漏，然后以1 mm/min 的速度緩慢撤回。顱骨鉆孔用骨蠟封閉，縫合頭皮切口。皮下注射0.4 mL 生理鹽水以避免術后脫水。在密切觀察下使小鼠從麻醉中完全恢復。假手術是按照相同的程序進行的，沒有注射全血。

1.2 實驗分組在本研究中，所有小鼠都被隨機分配到以下實驗中。（1）為了評估ICH 后腦中內源性GRP78 表達的時間過程，將42 只小鼠隨機分為7 組（n=6/組）：分別為假手術、ICH 后3、6、12、24、48、72 h 組。采用Western blot 檢測各組血腫周圍區域GRP78 的表達。（2）為了評估GRP78 靶向抑制劑HA15 在ICH 中的神經保護作用，將36 只小鼠隨機分為3 組（n= 12/組）：假手術、ICH + 載體（PBS）、ICH + HA15。HA15（美國MCE 公司）溶于PBS 中，并在ICH 后1 h 鼻內施用HA15（劑量為0.5 μg/kg）。在ICH 后24、72 h 評估神經行為測試和腦水含量，每個時間點每組各分配6 只小鼠進行測定。（3）為了評估用HA15 抑制GRP78 對ICH后24 h 神經炎癥和神經凋亡的影響，將54 只小鼠隨機分為3 組（n= 18/組）：假手術、ICH + 載體（PBS）和ICH+HA15（0.5 μg/kg）。在ICH 后1 h 鼻內施用HA15。在ICH 后24 h，進行神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的免疫熒光染色（n= 6/組）以計數血腫周圍區域的GFAP 陽性細胞（20 ×，平均來自3 個視野/切片，10 個切片/鼠標）。使用雙標記免疫熒光染色評估GRP78 的星形膠質細胞定位（n= 6/組），并計數血腫周圍區域的GFAP+GRP78+細胞（20 ×，平均來自3 個視野/切片，10 個切片/鼠標）。使用TUNEL 法評估神經元凋亡（n=6/組），并計數血腫周圍區域的TUNEL 陽性染色神經元（40 ×，平均來自3 個視野/切片，10 個切片/鼠標）。（4）為了評估用HA15 抑制GRP78 對ICH 后24 h 血腫周圍區域ER 形態學變化和應激情況，將總共24 只小鼠隨機分為3 組（n= 8/組）：假手術、ICH+載體（PBS）、ICH+HA15（0.5 μg/kg）。在ICH后1 h 鼻內施用HA15。在ICH 后24 h，各取2 只小鼠進行透射電鏡觀察腦組織形態學變化。每組其余6 只小鼠取血腫周圍區域組織，進行Western blot 分析ER 應激的經典下游標志物Caspase 12 和CHOP 蛋白表達。

1.3 短期神經行為評估在ICH 后24、72 h，使用改良的Garcia 評分測試、前肢放置測試和轉角測試評估短期神經行為功能［9］。

1.4 腦含水量測量通過濕/干方法測量腦含水量［10］。

1.5 透射電子顯微鏡觀察ER結構小鼠麻醉后用經心灌注0.1 mol/L PBS，再灌注4%多聚甲醛（pH 7.4）。獲得1 mm3的血腫周圍區域組織，并浸泡在4 ℃2.5%戊二醛溶液（pH 7.40）固定24 h。隨后，將組織放入1%四氧化鋨中1 h，并用一系列分級乙醇對組織進行脫水。再將組織浸入環氧丙烷和樹脂（1∶1）的混合物中。4 h后，將組織埋入樹脂中，并切割成100 nm 截面，使用4%醋酸鈾酰（20 min）和0.5%檸檬酸鉛（5 min）染色。最后用TECNAI10 透射電鏡（德國Philips 公司）觀察腦組織的ER 結構。

1.6 免疫組化對于體內實驗，將小鼠麻醉并隨后用4%多聚甲醛灌注。取出大腦并在4%多聚甲醛中固定［10］進行免疫組化。

1.7 Western blot 分析將組織或細胞用1×RIPA緩沖液勻漿，在4 ℃下以14 000 ×g 離心10 min，并通 過Bradford 方 法 測 量 上清液蛋白質［11］，進行Western blot 分析。

1.8 統計學方法使用Graph Pad Prism 進行統計分析。計量數據表示為均數±標準差。使用單向方差分析（ANOVA）和Tukey 事后分析對多重比較進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICH后GRP78在大腦皮層中的表達水平與假手術組相比，腦出血小鼠血腫周圍區域中GRP78水平在ICH 后3 h 開始上升，并在24 h 達到最高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ICH 后血腫周圍區域GRP78 時間進程的代表性蛋白質印跡圖像和定量分析Fig.1 Representative Western blot images and quantitative analysis of GRP78 time course in the area around hematoma after ICH

2.2 HA15 抑制GRP78 可改善ICH 后神經行為缺陷并減少腦水腫在ICH 后24 h 和72 h，與假手術組相比，ICH 小鼠的神經行為評分顯著更低，腦水腫更高。在ICH 后24 h 和72 h，與ICH+PBS 組相比，ICH+HA 組小鼠神經功能缺損顯著改善（P＜0.05），并且基底神經節和皮質的腦水腫顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 HA15 對ICH 后24 h 和72 h 的神經行為測試、腦水含量的影響Fig.2 Effect of ha15 on neurobehavioral test and brain water content 24 and 72 hours after ICH

2.3 HA15 抑制ICH 后星形膠質細胞增生和神經細胞凋亡由于ICH 后星形膠質細胞增生與神經功能缺損、神經炎癥和細胞凋亡密切相關，因此研究進行了GFAP的免疫熒光以評估ICH后24 h星形膠質細胞增生。與假手術組相比，ICH+PBS組小鼠血腫周圍區域星形膠質細胞明顯增加（P＜0.05）。然而，這種效果在HA 治療的ICH 小鼠中被部分逆轉（圖3A）。此外，免疫雙染顯示，ICH + PBS 組小鼠血腫周圍區域GFAP + GRP78+細胞較假手術組顯著增加（P＜0.05），而HA治療后GFAP+GRP78+細胞顯著下調（P＜0.05，圖3B）。細胞凋亡是ICH引起損傷的標志，TUNEL 染色顯示ICH+PBS 組小鼠血腫周圍區域TUNEL 陽性神經元的數量顯著增加（P＜0.05），這種效應在HA 治療的ICH 小鼠中被部分消除（圖3C）。

圖3 HA15 對ICH 大腦的神經保護作用Fig.3 neuroprotective effect of ha15 on ICH brain

2.4 ICH 誘導后24 h 血腫周圍區域ER 形態學變化和應激情況TEM顯示，與假手術組相比，ICH組在ICH 后24 h 血腫周圍區域中破裂和腫脹ER 增加，而HA15 處理減少了破裂和腫脹ER（圖4A）。Caspase 12 和CHOP 是ER 應激的經典下游標志物，它們在ICH 后24 h 血腫周圍區域中被強烈激活或升高，而HA15 處理減少了二者表達（圖4B、C）。

圖4 ICH 誘導后24 h 血腫周圍區域ER 形態學變化和應激情況Fig.4 Er morphological changes and stress in the area around hematoma 24 hours after ICH induction

3 討論

本研究探討了GRP78 激活在小鼠ICH 后神經炎癥中的作用，結果發現：（1）在血腫周圍區域中GRP78 的內源性表達在ICH 發生后逐漸增加并在24 h 后達到峰值。（2）GRP78 靶向抑制 劑HA15（0.5 μg/kg）在ICH 后1 h 鼻內給藥顯著改善神經功能缺損和減少腦水腫，并減少星形膠質細胞增生、神經細胞凋亡和ER 應激。（3）體外LPS 誘導的星形膠質細胞的炎癥模型顯示HA15 通過抑制星形膠質細胞中GRP78 表達，抑制星形膠質細胞中ER 應激和促炎細胞因子分泌，進而保護神經元免受LPS 誘導的損傷。這初步闡述了ICH 發病中ER應激的意義。

近年來，許多研究表明，ER 應激介導的細胞凋亡在ICH 出血后早期腦損傷中起重要作用［13］。ER 是一種主要控制蛋白質合成和進一步加工的細胞器。炎癥、氧化應激、線粒體鈣超載通過干擾ER 功能引起ER 應激［14］。ER 應激的過度激活導致ER 中錯誤折疊蛋白水平的升高和積累。GRP78作為ER應激的主要效應分子，其在非ER應激條件下，可以與三個主要ER 應激傳感器（PERK、ATF6和IRE1）的ER 內端結合，保持它們的非活動狀態［5］。在ER應激過程中，GRP78與這三個分子分離。本研究表明，GRP78 蛋白表達在ICH 后24 h 內逐漸增加，表明ER 應激可能在ICH 后被持續激活。然而，當發生過量的ER應激時，細胞的正常功能將無法恢復，導致轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）上調，激活Caspase?12 介導的細胞凋亡途徑［15］。此外，轉錄因子CHOP 可以下調抗凋亡Bcl?2 蛋白并增加促凋亡Bax 蛋白的表達。本研究結果表明，在ICH 小鼠模型中，Caspase 12和CHOP 表達顯著上調，而HA15 可以減少過量的ER應激，表現為Caspase 12 和CHOP 表達降低。噻唑苯磺酰胺化合物HA15 是GRP78 的新型抑制劑，已被證明結合并抑制必需的ER 伴侶GRP78，可強烈抑制ER 應激途徑［16-18］。

因此，GRP78 蛋白通過介導過量的ER 應激參與ICH 腦損傷。本研究較好闡述了ER 應激在ICH中的具體作用途徑及機制，有助于進一步了解ICH腦損傷的病理生理過程，從而為預防該疾病提供策略。ICH損傷會刺激星形膠質細胞的損傷和促炎細胞因子的釋放，如TNF?α、IL?1β 和IL?6［17］。星形膠質細胞有助于神經炎癥過程，已成為未來治療方法的一個有吸引力的靶標［18］。整體研究結果顯示GRP78 介導的星形膠質細胞激活與ICH 神經元存活和腦功能恢復密切相關［19-20］。

總之，本研究結果表明ER 應激蛋白GRP78 通過介導星形膠質細胞炎性活化參與ICH 后神經損傷。GRP78靶向抑制劑HA15可能對ICH 后神經元存活產生積極影響，應進一步研究其作用機制。本研究可進一步深入研究臨床藥物干預ER 應激的可能，為以后治療ICH腦損傷提供途徑。