綠豆皮中黃酮類化合物的抗氧化活性及其結構分析

陳洪生，國 慧，刁靜靜 ，張東杰,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學，國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學，糧食副產物綜合利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata）是一種藥食同源的食用豆，其富含蛋白質、碳水化合物、礦物質和維生素，還含有豐富的多酚、酚酸和黃酮類化合物等活性成分，這些活性成分由于其較強的抗氧化能力而有利于預防癌癥、糖尿病、心血管疾病等非傳染性慢性病[1?2]。我國在對綠豆進行工業利用過程中會產生大量綠豆皮，這些綠豆皮多被用作動物飼料或者直接廢棄物[3]。綠豆皮中含有大量的黃酮類、多酚類化合物，這些功效成分具有抗腫瘤[4]、降低血脂、降膽固醇等生理功能[5]。因此，綠豆皮可以用來制取黃酮類物質，以提高資源利用率。近年來，國內外有關綠豆皮的研究主要集中在功能成分的制取及營養功效評價，朱文學等[6]采用超聲波輔助水提取綠豆皮黃酮工藝的研究；Yao等[4]和Peng等[7]的研究發現綠豆中富含多酚，這些酚類物質具有較強的DPPH自由基清除能力。Lee等[8]研究發現綠豆皮提取物黃酮具有抗炎作用。羅磊等[9]研究表明綠豆皮黃酮對氧化損傷人臍靜脈內皮細胞具有保護作用。以上這些研究都證實綠豆皮黃酮具有較好的抗氧化、抗炎等生物活性，但綠豆皮黃酮類物質中起主要作用的活性組分的具體組成，目前還不甚清楚。

本試驗采用自主研制的連續化制備色譜對綠豆皮黃酮粗提物進行梯度分離，收集不同分級產物分析其抗氧化能力，采用LC-MS分析具有最強抗氧化能力級分的結構，以得出綠豆皮黃酮中最強抗氧化活性的組分結構，以期為綠豆皮的高值化利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西明綠豆 大慶薩爾圖區博微物資經銷處；AB-8大孔吸附樹脂 購于天津南開大學樹脂有限公司；蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-iphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline -6-sulphonic acid，ABTS） 上海Macklin公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） Sigma公司；乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、三氯化鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、氧氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁等試劑安達市清順化學試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-COA）試劑盒 購于南京建成生物工程研究所。

AL-204電子天平 北京瑞澤康科技有限公司；粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；連續化制備型不銹鋼分離柱 實驗室自制；UPLC-Triple-TOF/MS系統：AcquityTMultra型高效液相色譜儀 美國Waters 公司；TU1810 型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；CW-200 型超聲-微波協同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆皮黃酮粗提液的制備 采用康維良等[10]的方法稍作改動，將綠豆皮在40 ℃下恒溫干燥，粉碎，過80目篩后密封保存。配制料液比為1:31（g/mL）綠豆皮粉末樣品溶液，采用超聲-微波協同萃取儀進行綠豆皮黃酮的提取，微波功率為521 W，時間30 min，結束后將提取物進行3500 r/min離心10 min，收集上清液，低溫保存備用，得到綠豆皮黃酮粗提液（測得綠豆皮提取物中黃酮含量為2.26%）。

1.2.2 綠豆皮黃酮的分離純化 采用本實驗室自制的連續化制備型不銹鋼分離裝置，根據課題組前期分離純化條件對綠豆皮黃酮粗提物進行分離純化。以1 mL/min流速將綠豆皮黃酮粗提物泵入分離柱中進行飽和吸附，然后分別采用1~1.5倍體積的20%、40%、60%、80%乙醇進行梯度洗脫，收集不同洗脫級分的洗脫液備用。

1.2.3 綠豆皮黃酮抗氧化能力的測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照陳青青等[11]方法稍作改動，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），加入3.9 mL DPPH（30 μmol/L）溶液，避光30 min，517 nm測吸光度，按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為靜置30 min后樣品的吸光度；A2為等體積的乙醇對照的吸光度；A3為待測樣品與DPPH等體積乙醇吸光度。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除能力 參照陳青青等[11]方法，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），加入5 mL ABTS+·工作液靜置10 min，734 nm測吸光度，以0.1 mL乙醇作為對照。ABTS+自由基清除率按式（2）計算；

式中：AS為乙醇對照組吸光度；Am為樣品吸光度。

1.2.3.3 羥自由基清除能力 參照封燕等[12]的方法稍作改動，分別取樣品0.1 mL樣品（濃度2%），依次加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴 30 min，510 nm測吸光度，以0.1 mL蒸餾水代替樣品作為對照組。羥自由基清除率按式（3）計算；

式中：Ai為待測樣品吸光度；Aj為對照組吸光度；A0為雙蒸水代替H2O2溶液作為底物對照的吸光度。

1.2.3.4 T-AOC的測定 采用T-AOC檢測試劑盒進行分析。

1.2.4 綠豆皮黃酮類化合物的結構分析 稱取10 mg凍干后的樣品粉末，加甲醇10 mL溶解，10000 r/min離心15 min，取上清液用于測試。使用0.1%甲酸乙腈為流動相，流速為0.5 mL/min，檢測波長280 nm。采用Waters T3色譜柱（50 mm×3.0 mm i.d. ,1.8 μm），進樣量5 μL，柱溫箱40 ℃。采用UPLC-Triple-TOF/MS系統進行黃酮結構測定，并根據Scifinder和Reaxy數據庫檢索和推測黃酮類化合物組分。

1.3 數據處理

所得數據均為三次重復的平均值，用Statistix 8（分析軟件, St Paul, MN） 進行數據分析，平均數之間顯著性差異（P<0.05）通過Turkey HSD進行多重比較分析。并采用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結果與分析

2.1 綠豆皮黃酮類化合物的分離

圖1 反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫樣品圖。由圖1可知，綠豆皮黃酮飽和吸附后，采用不同洗脫溶劑等體積洗脫制備得到的綠豆皮黃酮級分濃度不同，隨著洗脫劑乙醇濃度的增強，洗脫樣品的顏色也逐漸變深，其中60%洗脫樣品顏色最深，表明60%洗脫樣品中得到的溶質相對較多，80%醇洗液在連續分離中既可將分離柱中的剩余組分洗脫下來，還可起到清洗分離柱的效果，以保證分離柱的下一輪吸附洗脫。圖2反映的是綠豆皮黃酮梯度洗脫四個級分的得率。由圖2可知，四種洗脫溶劑得到的黃酮類化合物濃度分別為0.0056、0.021、0.0257、0.0044 mg/mL，與圖1結果結合分析得出，綠豆皮黃酮類化合物集中在40%和60%洗脫樣品中，達到綠豆皮黃酮粗提物的80%以上；其中60%洗脫樣品濃度最高；20%醇洗液由于極性相對較低，洗脫液中含量較低；由于綠豆皮黃酮類化合物集中在40%和60%洗脫樣品中，因而80%醇洗液中樣品也較低。結合圖1和圖2也可以看出綠豆皮黃酮類化合物組分集中在40%~60%醇洗液中。

圖1 綠豆皮黃酮洗脫樣品圖Fig.1 Elution sample diagram of flavonoids from mung bean hull

圖2 綠豆皮提取物梯度洗脫樣品黃酮濃度Fig.2 Concentrations of flavonoid of mung bean hull extract by gradient elution

2.2 不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力

圖3 反映的是梯度洗脫后不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力。由圖可知，等濃度的各個洗脫級分的DPPH·、ABTS＋·、·OH清除能力和總抗氧化能力不同，20%、80%洗脫級分的抗氧化能力最低，60%洗脫級分的抗氧化能力顯著強于其他洗脫級分（P<0.05），與未分級樣品相比，60%洗脫級分的ABTS＋·、·OH清除能力和總抗氧化能力顯著高于等濃度的黃酮粗提物（P<0.05），但DPPH·清除能力顯著低于黃酮粗提物（P<0.05），這說明洗脫樣品中的組分與未分級綠豆皮黃酮粗提物存在不同，不同的抗氧化組分其作用效果及機理不同，這與自由基種類也存在一定的相關性，ABTS+·和·OH屬于帶電荷的自由基，而DPPH·卻并不帶電荷，所以抗氧化效果不同；40%洗脫級分盡管抗氧化能力強于20%和80%洗脫樣品，但顯著低于60%洗脫級分（P<0.05），這也表明不同洗脫樣品中的組分不同，因此抗氧化能力不同，也表明綠豆皮黃酮中主要抗氧化組分集中在60%洗脫液中。

圖3 不同級分綠豆皮黃酮的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of mung bean hull flavonoid from different fractions

2.3 60%醇洗脫綠豆皮黃酮類化合物結構分析

圖4 反映的是60%醇洗樣品的液相色譜圖，由圖可知，純化后綠豆皮黃酮樣品中的吸收峰主要有3個，分別出現在4.59、6.06和6.20 min，說明60%醇洗脫液中綠豆皮黃酮類化合物主要含有3種物質。

圖4 60%乙醇洗脫液中黃酮類化合物的液相分析圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of mung bean hull flavonoids in 60% ethanol elution liquid

2.3.1 成分Ⅰ分析 圖5是成分I的一級二級質譜圖和可能的結構式。該化合物的出峰時間為4.59 min，[M-H]?為449.1107，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C21H22O11，根據二級質譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物為碳苷，且含有六元糖，根據cifinder和reaxy數據庫檢索，推測該化合物為圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷（eriodictyol-6-C-β-D-glucopyranoside）。

圖5 成分Ⅰ的一級（A）、二級（B）質譜及可能的結構式（C）Fig.5 Ingredients I primary(A), secondary(B) mass spectrogram and possible structural formula(C)

2.3.2 成分Ⅱ分析 圖6是成分II的一級二級質譜圖和可能的結構式。該化合物的出峰時間為6.06 min，[M-H]?為431.0992，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C21H20O10，根據二級質譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據Scifinder和Reaxy數據庫檢索，根據保留時間分析，推測該化合物為牡荊素（vitexin）。

圖6 成分Ⅱ的一級（A）、二級（B）質譜及可能的結構式（C）Fig.6 Ingredients II primary(A) , secondary(B) mass spectrogram and possible structural formula(C)

2.3.3 成分Ⅲ分析 圖7是成分III的一級二級質譜圖和可能的結構式。該化合物的出峰時間為6.20 min，[M-H]?為431.1007，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C21H20O10，根據二級質譜[M-90-H]、[M-120-H]等碎片離子，該化合物的為碳苷，且含有六元糖，根據Scifinder和Reaxy數據庫檢索，推測該化合物為異牡荊素（isovitexin）。

圖7 成分Ⅲ的一級（A）、二級（B）質譜及可能的結構式（C）Fig.7 Ingredients III primary(A), secondary(B), mass spectrogram and possible structural formula(C)

3 討論與結論

本研究結果表明，綠豆皮較強的抗氧化活性與其富含黃酮類化合物有關。羅磊等[9]和Kanatt等[13]的研究表明，綠豆皮比仁核具有較強的抗氧化性，這是由于皮殼中含有較高的黃酮類化合物。Li等[14]的研究發現蕎麥皮殼中含有較高的黃酮類化合物，其主要黃酮類物質是牡荊素和異牡荊素，這兩種組分被認為是最主要的抗氧化劑。有研究表明綠豆具有清熱解毒作用是由于其活性部位提高了機體對氧自由基的清除能力，減輕了過量的氧自由基引起的機體損傷[15?17]。本研究通過連續制備色譜分離純化得出的抗氧化活性組分經鑒定推測出其主要含有牡荊素、異牡荊素和圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷。牡荊素和異牡荊素具有較高的抗氧化能力已被很多研究所證實，牡荊素能保護DNA氧化損傷，使細胞免受·OH誘導的氧化損傷，降低CSHFD小鼠肝臟脂肪沉積，減輕脂質代謝，抑制肝臟炎癥反應。此外，牡荊素可顯著降低肝巨噬細胞浸潤，明顯下調肝SREBP-1c、FAS、ACC mRNA和蛋白表達[18?19]。異牡荊素可通過抑制機體的氧化反應改善順鉑誘導的腎損傷[20]。黃酮類化合物的B環是其清除自由基的主要活性部位，當該環存在鄰酚羥基結構時，抗氧化活性增強。潘國慶等[21]的研究表明，B環上有鄰位羥基，自由基清除能力會顯著增強，如槲皮素比山萘素的B環上多了一個鄰位羥基，其活力顯著增強。胡棟寶等[22]的研究發現，黃酮類化合物的B環上含有鄰位羥基容易形成分子內氫鍵，這有利于分散苯氧自由基上的單電子，此種結構具有較高的抗氧化活性[23]。本研究推測的另外一種成分圣草酚-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷的B環上有一個鄰位羥基，由此，除了牡荊素和異牡荊素這兩種抗氧化組分外，這可能是60%洗脫樣品中綠豆皮黃酮具有較強抗氧化能力的另外一個原因。本文對綠豆加工副產物中綠豆皮的黃酮類化合物進行了提取及分離純化，鑒定出綠豆皮黃酮中具有較強抗氧化能力的3個組分結構，這為綠豆加工副產物資源的利用提供了理論依據。