加工方式對牛肉蛋白質氧化的影響

代媛媛，李美瑩，李 琳，陳瑞琦，查恩輝

（錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧錦州121000）

牛肉中蛋白質是人類能量和必需氨基酸的重要來源。加熱溫度是影響牛肉性能和微生物滅活階段的關鍵因素之一。高壓能有效消除致病菌和食品腐敗菌，提高食品的安全性并延長保質期[1]。蛋白質在熱處理過程中會經歷結構修飾如氧化、聚集、降解和變性。蛋白質氧化涉及許多其他精確的化學修飾，如色氨酸損失、羰基化、羧化和交聯的形成[2?4]。

近幾年，國內外學者針對肉類在加熱及高壓過程中蛋白質氧化測定的部分指標研究較廣。曹瑩瑩[5]研究發現隨著壓力增加，肌球蛋白的疏水基團和巰基含量逐漸增加。Wan等[6]研究結論得出，溫度從80 ℃升高到90 ℃時，水溶性膠原蛋白含量增加，對牛肉制品的風味、口感、嫩度和總體偏好無不良影響。Pang等[7]發現蒸煮過程中肌球蛋白和肌動蛋白含量的變化相似，說明肌原纖維蛋白的變性在蒸煮損失中起著關鍵作用。結果表明，肉類的蒸煮溫度和蛋白質變性之間有很強的相關性，說明加熱溫度引起了肉類蛋白質的變化。Scholliers等[8]研究發現在加熱過程中，牛肉蛋白凝膠特性與疏水相互作用的形成有關，加熱后肉蛋白表面疏水性的增加證實了這一點。Han等[9]在20~74 ℃條件下測定了蛋白質的構象和化學鍵，結果表明，在55 ℃以上，表面疏水性顯著增強，游離巰基含量降低。Edyta等[10]研究發現在壓力處理下會導致肉中蛋白質的變性和聚集現象。Stéphanie等[11]發現當壓力超過300 MPa時，蛋白質氧化產物增加，結構發生不可逆變化。熱處理對牛肉蛋白質氧化、結構和性能的影響國內外報道較少，不同部位的牛肉品質不同，適宜的加工方法也不同。

因此，本文研究對熱加工過程中不同溫度和70 kPa高壓下不同保壓時間對牛肉中羰基含量、巰基含量、蛋白粒徑、表面疏水性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白二級結構進行分析，以探究蛋白質氧化在熱加工過程中的變化規律，為選擇合適的原料，實現牛肉價值最大化，以及生產出不同加工方法下質優價廉的標準化產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛腱子、牛肩 錦州新瑪特超市；濃鹽酸、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸胍、氯化鎂、甲醇、溴化鉀、冰醋酸、乙醇、甘油、尿素、考馬斯亮藍染色液 唐山三鼎化工有限公司；溴酚藍、Tris、β-巰基乙醇、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硝基苯甲酸（DTNB）、十二烷基硫酸鈉（SDS） 煙臺健碩化工有限公司；所有試劑均為分析純。

JD-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；KH20R高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；CH6數字顯示溫度計 上海亞度電子科技有限公司；JJ-2高速勻漿機 常州潤華電器有限公司；HH-4D恒溫水浴鍋 上海比朗儀器制造有限公司；UT6紫外可見分光光度計 屹譜儀器制造有限公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳 濟南好來寶醫療器材有限公司；PHSJ-5型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；NKT-N9納米粒度儀 山東耐克特分析儀器有限公司；Great20傅立葉紅外光譜儀 中科瑞捷科技有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海爭巧科學儀器有限公司；高壓鍋 美的公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 清洗牛肉，然后去除脂肪和筋膜，切成3.0 cm×4.0 cm×5.0 cm的長方體，放在4 ℃的冰箱備用。處理牛肉分別采用兩種加工方式。

水浴加熱組：水浴鍋溫度設為 40、50、60、70、80、90、100 ℃，加熱30 min。

高壓保溫組：壓力為70 kPa，溫度為110 ℃，保壓時間設為15、20、25、30、35 min。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 參考Zhong等[12]方法稍加修改。將樣品冷卻至室溫，稱取10 g，加入20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl和pH7.0）定容至100mL，混合，搖勻，勻漿后在6000 r/min和4 ℃下離心10 min，取沉淀，加入50 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，在上述條件下離心，重復3次，然后加入25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0），使沉淀均勻。用四層紗布過濾，濾液為肌原纖維蛋白溶液。以牛血清蛋白為標準，在280 nm處測定吸光度，用雙縮脲法測蛋白濃度（mg/mL）。經考察，回歸方程y=0.0501x+0.0022，R2=0.9998。

1.2.3 羰基含量的測定 參考Marco等[13]方法稍加修改。取0.1 mL蛋白溶液和0.5 mL二硝基苯肼（DNPH）（溶劑為2 mol/L HCl），空白樣品不加DNPH，暗室靜置1 h（每20 min搖動1次），加5 mL 20%三氯乙酸，搖勻后，在10000 r/min，15 min條件下4 ℃離心，棄上清。沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1:1）洗滌3次。加入1 mL 6 mol·L?1鹽酸胍溶液，在37 ℃水浴20 min，然后10000 r/min下離心5 min。在370 nm波長處測定吸光度，羰基含量通過22000 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計算。

式中：A370為370 nm下的吸光度106為摩爾基礎單位；C為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.4 巰基含量的測定 參考Yang等[14]方法稍加修改。取0.1 mL蛋白溶液、1 mL 50 mmol·L?1Tris-HCl緩沖液（含有1mmol·L?1EDTA、6mol·L?1鹽酸胍，pH8.3）以及10 μL 10mmol·L?1DTNB，混合搖勻，室溫下靜置25 min，在412 nm處測定吸光度。巰基含量由13600 L/（mol·cm）的摩爾吸收率計算。

式中：A412為412 nm下的吸光度；106為摩爾基礎單位；C為測得的蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.5 粒徑的測定 參考Zhang等[15]方法稍加修改。利用納米粒度儀測定蛋白質粒徑。以去離子水為分散劑，粒子的折射率為1.414，吸收率為0.001。

1.2.6 表面疏水性的測定 參考Zhu等[16]方法稍加修改。取1 mL蛋白溶液，加入40 μL溴酚藍溶液（1 mg/mL），振蕩10 min，4 ℃下2000 r/min離心15 min，取上清稀釋10倍，在595 nm處測定吸光度。空白對照為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液。表面疏水性計算公式如下：

式中：A空白為空白組的吸光度；A樣品為樣品組的吸光度。

1.2.7 SDS-PAGE凝膠電泳 參考Shi等[17]方法稍加修改。電泳采用10%分離膠和5%濃縮膠。每個時期的上樣液量為5 μL，初始電泳電壓為75 V，樣品進入分離膠后，升壓至100 V，電泳結束后剝離膠片，考馬斯亮藍染色30 min，再用脫色液脫色3次。

1.2.8 傅里葉變換紅外光譜測定 參考Kun等[18]方法稍加修改。蛋白樣品在?20 ℃冷凍5 h，然后在冷凍干燥機中干燥12 h，取1 mg樣品放入研缽再和100 mg溴化鉀充分研磨成細粉。在模具內使分布均勻，將模具水平放置在模座上，加壓至10 t/cm2，保持1 min，用傅里葉紅外光譜儀進行分析，條件為：光譜范圍：500~4000 cm?1，分辨率：4 cm?1，掃描積累32次。

1.3 數據處理

采用Office 2019進行數據處理及圖表繪制，計算標準差。

2 結果與分析

2.1 不同加熱方式對蛋白羰基含量的影響

羰基的形成是蛋白質氧化的一個明顯標志，反映了蛋白氧化損傷的程度。由圖1可見，隨著溫度的升高和保壓時間的延長，蛋白質羰基含量逐漸增加。在蒸煮和高壓加熱過程中，蛋白質結構發生變化，大部分肌漿蛋白、肌球蛋白和肌動蛋白變性，細胞膜結構遭到破壞，導致鐵等過渡金屬離子釋放。活性氧和無氧自由基是由催化劑或前體產生的，包括一些血紅素、過渡金屬離子和各種氧化酶。這些自由基攻擊蛋白質，催化蛋白質氧化，導致羰基含量增加[19]。羰基值的增加也可能是脂質氧化的產物。肽骨架裂解成短肽和蛋白質也可以與還原糖反應生成羰基。熱處理后的牛肉肌原纖維蛋白發生蛋白質氧化反應，由于水浴持續加熱時間較長，更容易誘導肉中脂肪氧化和蛋白質羰基的形成。但高壓下升溫速度快，可能導致脂肪氧化和羰基氧化水平低于水浴加熱。牛腱子的羰基含量較牛肩低，是由于牛腱子脂肪含量較牛肩低，所以氧化程度較低。Xiong等[20]發現超高壓與熱處理相結合時，豬肉脂肪氧化程度增加，這可能是蛋白質氧化的誘因之一。

圖1 不同加熱方式對蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effect of different heating methods on protein carbonyl content

2.2 不同加熱方式對蛋白巰基含量的影響

肌原纖維蛋白中存在大量巰基，氧化條件下易轉化為二硫鍵，造成巰基含量下降。所以，巰基對維持蛋白質的結構穩定性起著重要作用。

由圖2A可知，隨著溫度的升高，巰基含量先升高后降低。熱加工過程影響肌動球蛋白的解離程度，40~60 ℃可以導致肌動蛋白解離，60 ℃是促進肌動蛋白解離的最佳溫度，因此60 ℃時巰基含量最高[21]。當溫度繼續升高時，肌動球蛋白構象改變，巰基被氧化成二硫鍵，使巰基含量降低。從圖2B可以看出，巰基含量隨著保壓時間的增加而減少。這表明肌原纖維蛋白在高壓處理下打開，巰基通過二硫鍵聚集。因為在高壓處理下巰基暴露在分子表面，與空氣中的氧充分結合形成二硫鍵致使巰基減少[22]。萬紅兵等[23]發現，在牛排的油炸過程中，熱處理對巰基和二硫鍵的含量有顯著影響，牛肉蛋白中巰基含量先升高后降低。

圖2 不同加熱方式對蛋白巰基含量的影響Fig.2 Effect of different heating methods on protein sulfhydryl content

2.3 不同加熱方式對蛋白粒徑的影響

粒徑是反應蛋白聚集狀態的一個指標，在一定程度上可以反映反應蛋白在降解過程中的狀態。

由圖3可知，隨著溫度的升高和保壓時間的延長，蛋白質的粒徑逐漸增大。在80 ℃、保壓25 min時，牛腱子的粒徑最大，而在70 ℃、保壓25 min時，牛肩的粒徑最大；繼續加熱，蛋白質的粒徑逐漸減小，這進一步說明在熱加工過程中，蛋白質在加熱的作用下首先形成聚集現象。另一方面，然后持續加熱，蛋白質變性，使其中一些不耐熱的化學鍵發生斷裂，減弱了交聯作用，結果蛋白質聚集體被部分破壞，因此粒徑變小[24]。在高壓過程中，當時間在15~25 min時，蛋白質進一步變性，蛋白質膨脹程度增加，變性蛋白通過分子內或分子間的相互作用增強了蛋白質的聚集程度，形成的聚集物尺寸增大，導致蛋白質粒徑增大；隨著時間的進一步增加，蛋白質的聚集率增加，打破了蛋白質變性率和聚集率之間的平衡，形成的聚集體無序，不能形成較大的聚集體，或者形成的聚集體不穩定，不能保持原來的形態，導致粒徑減小[25]。

圖3 不同加熱方式對蛋白粒徑的影響Fig.3 Effect of different heating methods on protein particle size

2.4 不同加熱方式對蛋白表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性反映其結構穩定性，并影響蛋白凝膠形成。疏水相互作用對蛋白凝膠的形成和蛋白結構的穩定性起著非常重要的作用。

由圖4A得出，隨著溫度的升高，蛋白質的表面疏水性逐漸增加，在80 ℃時牛腱子達到最大值，在70 ℃時牛肩達到最大值，然后隨溫度升高而降低。其原因可能是隨著溫度的升高，蛋白質疏水側鏈的暴露程度增加，使蛋白質的水溶性環境變為疏水性環境，導致表面疏水性增加。70~80 ℃后肌球蛋白變性，肌原纖維蛋白聚集體與側鏈之間發生反應，產生沉淀[26?27]。隨著蛋白質聚集度的增加，少量疏水基團被再次包埋，疏水基團的結合降低了表面疏水性。從圖4B可以看出，蛋白質的疏水性隨著保壓時間的增加而增加。壓力使肌原纖維蛋白展開，暴露出蛋白質的疏水殘基，同時壓力可誘導蛋白質表面出現特殊氨基酸殘基，導致疏水性增加。表面疏水性變化也可能是因為蛋白質的降解。

圖4 不同加熱方式對蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effect of different heating methods on hydrophobicity of protein surface

2.5 SDS-PAGE凝膠電泳結果

肌原纖維蛋白主要由副肌球蛋白（100 kDa）、肌鈣蛋白（75 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）、肌球蛋白重鏈（200 kDa）等組成。

肌原纖維蛋白經高溫高壓后進一步降解，造成其變性。如圖5所示，隨著溫度升高，牛腱子中的肌原纖維蛋白出現降解和聚集，導致許多電泳條帶在245~75 kDa范圍內明顯模糊，甚至消失。隨著溫度的升高，200 kDa處的肌球蛋白重鏈帶顏色逐漸變淺，在50~80 ℃時可以看到條帶密度的明顯變淺，這可能是由于高溫加熱，導致蛋白質之間產生了相互作用，在90~100 ℃溫度下條帶基本消失，表明溫度過高使得蛋白質的變性和聚集速度加快，肌球蛋白重鏈結構被破壞，使其分解，說明肌球蛋白重鏈具有不耐熱性，這可能是由于某些蛋白質隨著溫度的升高而變性所致，高溫使肌球蛋白重鏈分解，形成分子量小的肌球蛋白輕鏈，肌動蛋白也分解成原肌球蛋白，造成條帶顏色變淺。另外，由于肌球蛋白重鏈在加熱后聚集成大分子，不能進入電泳條帶，因此在凝膠濃縮液的上界面無法觀察到大分子蛋白形成的條帶，使蛋白條帶顏色變淺[28?29]。而在40 ℃時43 kDa處的肌動蛋白略有降解，但隨溫度的升高，沒有觀察到肌動蛋白條帶的顯著差異，可能是肌動蛋白通過非共價鍵與肌球蛋白相互作用，如疏水相互作用。也可能是肌動蛋白聚合導致變性，形成聚集體，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和由內源轉化酶誘導的?-（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵是形成蛋白質聚集體的主要化學鍵。進一步說明肌球蛋白的熱穩定性沒有肌動蛋白比高[30]。此外，35~45 kDa范圍內的蛋白質條帶數量隨溫度升高急劇增加，這表明在此期間也發生了蛋白水解降解。

圖5 不同溫度下牛腱子蛋白質SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of bovine tendon protein at different temperatures

如圖6所示，隨著保壓時間的延長，肌球蛋白重鏈條帶顏色變淺甚至消失，可能是肌球蛋白重鏈對壓力不穩定，高壓導致這些蛋白質降解，抑制肌球蛋白的交聯，從而使肌原纖維蛋白解聚作用，溶解度降低。而肌動蛋白的條帶一直存在，在15 min時略有降解，隨后顏色加深，在35 min時條帶顏減弱，表明肌動蛋白在高壓加熱過程中部分分解。Zhang等[31]的電泳結果表明，鰱魚魚糜凝膠在加熱過程中MHC帶的強度隨著加熱溫度和時間的增加而急劇下降，而25~35 kDa范圍內的蛋白質條帶數量急劇增加。

圖6 不同保壓時間對牛腱子蛋白質SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of aponeurosis protein with different pressure holding time

不同熱處理引起蛋白質降解的差異與傳熱介質有關，不同于蒸煮加熱過程中由外到內的傳熱方式，高壓使極性分子在加熱過程中通過摩擦產生熱量，而高壓加熱速率較快，因此結構破壞最為嚴重，造成蛋白質降解嚴重。然而，SDS-PAGE結果顯示，在蒸煮過程中，蛋白質的降解相對溫和。

2.6 不同加熱方式對肌原纖維蛋白二級結構的影響

常見的蛋白質二級結構可分為α-螺旋、β-折疊、β-螺旋和無規卷曲。在高溫高壓作用下，蛋白質二級結構發生變化，造成不可逆轉變。蛋白質紅外光譜主要集中在1600~1700 cm?1的酞胺Ⅰ帶，這是蛋白質二級結構最敏感的區間，常用來分析蛋白質二級結構[32]。

由圖7可知，牛肉肌原纖維的酰胺A帶由3448 cm?1向3423 cm?1移動，這可能是酰胺A帶的N-H伸縮振動和氫鍵締合的形成，改變了位移，說明氫鍵產生變化。不同溫度處理組和不同保壓時間組的蛋白酰胺Ⅰ帶的吸收峰形狀相似，但兩個波數位置不同，說明傳統水浴加熱肌球蛋白的二級結構不同于高壓肌球蛋白。隨著溫度的增加和保壓時間的延長，不同溫度下牛腱子酰胺Ⅰ帶從1658 cm?1變為1616 cm?1，牛肩酰胺Ⅰ帶從1656 cm?1變為1618 cm?1，而高壓下牛腱子酰胺Ⅰ帶從1653 cm?1變為1622 cm?1，牛肩酰胺Ⅰ帶從1652 cm?1變為1622 cm?1，說明加熱后牛肉肌原纖維的α-螺旋結構先轉變為無規則卷曲結構，再轉化為β-折疊。加熱導致蛋白質變性，從而破壞羰基和氨基之間的氫鍵，α-螺旋分裂，可能向無規則卷曲和β-折疊轉化。在加熱后期，水分子隨著二級結構的膨脹而遷移，疏水基團和巰基的暴露提供了較大的空間。此時，蛋白質逐漸聚合，β-折疊結構開始分解，分子間的疏水作用形成無規則卷曲[33]。可以看出，隨著熱處理溫度的升高和保壓時間的延長，酰胺Ⅰ帶的峰值位置向低的波數移動，這反映了蛋白質在熱處理過程中的變性和蛋白質從α-螺旋轉化為無規則卷曲和β-折疊。

圖7 不同加熱方式對肌原纖維蛋白二級結構的影響Fig.7 Effect of different heating methods on secondary structure of myofibrillar protein

3 結論

隨著溫度的升高，蛋白羰基含量逐漸增加，巰基含量呈現先升高后降低的變化趨勢，蛋白粒徑增大，蛋白表面疏水性先增大后減小。隨著保壓時間的延長，蛋白羰基含量增加，巰基含量減少，蛋白粒徑先增大后減少，蛋白疏水性逐漸增加。SDS-PAGE研究發現，隨著溫度升高，肌球蛋白重鏈發生了降解明顯，而肌動蛋白加熱后開始略有降解，隨著溫度升高沒有明顯的變化趨勢；在高壓條件下，肌球蛋白重鏈條帶逐漸減弱甚至消失，而在不同保壓時間肌動蛋白條帶無明顯變化。與高壓相比，在蒸煮過程中，蛋白質的降解相對溫和。紅外結果表明，隨著溫度的升高和保壓時間的延長，酰胺Ⅰ帶的峰值位置向低的波數移動，反映蛋白質在熱處理過程中的變性和蛋白質從α-螺旋轉變為無規則卷曲和β-折疊。本文為不同部位的牛肉精深加工精確工藝參數的設定提供了有力的理論依據。