銀耳多糖對淀粉消化酶的抑制作用及其機理研究

杜沁嶺，楊 芳,2，徐 文，繆 婷，曹俊杰，賈冬英,

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065；2.百事食品（中國）有限公司，上海 200023；3.成都巨龍生物科技股份有限公司，四川成都 611131）

多糖是銀耳的主要活性成分，占其干重的60%~70%，具有抗衰老[1]、降血糖[2]、降血脂[3]、調節免疫[4]等作用，在食品和醫藥領域顯示出良好的應用前景[5]。小腸內淀粉的消化是在兩種淀粉消化酶，即α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的催化下逐步水解成葡萄糖的過程，其中前者可催化淀粉水解成麥芽糖、α-極限糊精和少量葡萄糖，是淀粉水解的先決條件；后者可將麥芽糖和α-極限糊精進一步水解成為葡萄糖，是控制葡萄糖釋放的關鍵酶[6]。因此，抑制淀粉消化酶就能減少食物中淀粉的消化，延緩餐后血糖的升高。研究表明，活性多糖可通過抑制α-淀粉酶和α-葡糖糖苷酶的活性降低淀粉消化速率[7?8]。

動物實驗研究結果顯示，銀耳多糖（Tremella fuciformispolysaccharide, TP）具有降血糖作用。Cho等[9]研究表明銀耳胞外多糖可顯著降低小鼠的血糖水平，提高其口服葡萄糖耐量，激活PPAR-γ的表達；銀耳胞外多糖可能通過調節PPAR-γ-介導的脂質代謝發揮明顯的降血糖和增強胰島素敏感性的作用。田春雨等[10]研究了銀耳多糖對鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響，發現該多糖可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平，并能緩解糖尿病所引起的多食、多尿、體重減輕等癥狀。然而，目前有關銀耳多糖的降血糖作用機制尚不明確，并且關于其延緩淀粉體外消化的研究也鮮見報道。基于此，本文中研究了銀耳多糖對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用，分析了其對該兩種酶結構的影響和可能的抑制作用機理。研究結果既可豐富銀耳多糖的降血糖作用理論，還能為其精細化利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干銀耳 福建古田袋料栽培銀耳，市售；葡萄糖系列標準品（分子量范圍2.5~5348 kDa） 色譜純，美國Sigma公司；牛血清蛋白 上海阿拉丁試劑有限公司；瓜爾膠 山東廣浦生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（>10 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg） 上海源葉生物科技公司；DEAE纖維素-52、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 北京索萊寶科技公司；其它化學試劑 均為國產分析純。

UV6000PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ZWY-100H恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Synergy H1型全功能微孔板檢測儀 美國Biotek公司；F-7000熒光分光光度計 日立高新技術公司；J-1500-150型圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀耳多糖的制備 參考并適當修改Lu等[11]報道的堿法提取銀耳多糖。將1.0 g干銀耳放入80 mL的去離子水中，于室溫下浸泡20 min后打漿，用0.1 mol/L NaOH溶液調整其pH至12.0，50 ℃下提取4 h，過濾后以8000 r/min離心15 min，收集上清液。在25 mL上清液中加入3%（w/v）木瓜蛋白酶，混勻后以1 mol/L HCl調節其pH至6.5，于55 ℃下酶解2 h，沸水浴10 min，冷卻至室溫后于8000 r/min離心20 min，將所得上清液依次進行透析、濃縮、醇沉和真空干燥，得到脫蛋白銀耳多糖。將其配制成濃度為5 mg/mL溶液，取10 mL上樣，采用DEAE-52柱層析對其進行純化，先用去離子水洗脫，然后依次以0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫，收集峰面積最大的洗脫液，將其合并后依次進行透析、真空濃縮、冷凍干燥，得到白色絮狀的純化銀耳多糖（TP）。經測定，TP總糖含量為92.45%，蛋白質含量為0.22%。

1.2.2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的測定 適當修改Ademiluyi等[12]的方法測定TP對α-淀粉酶活性的抑制作用。移取不同濃度TP溶液（1、2、4、6、8和10 mg/mL）100 μL，加入1%（w/v）馬鈴薯淀粉溶液100 μL，于25 ℃孵育10 min后加入0.5 mg/mL胰α-淀粉酶溶液100 μL，繼續孵育10 min，振蕩后加入3,5-二硝基水楊酸試劑200 μL，沸水浴5 min，冷卻至室溫后加入去離子水2 mL，混勻后測定反應液在540 nm處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對照。按照以下公式計算樣品對胰α-淀粉酶的抑制率。

將Li等[13]的方法適當修改后測定TP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。移取不同濃度TP溶液（1、2、4、6、8和10 mg/mL）40 μL，加入0.1 U/Lα-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混勻后于37 ℃孵育5 min，加入5 mmol/L PNPG溶液20 μL，混勻后繼續孵育30 min，加入0.2 mol/L碳酸鈉溶液50 μL，混勻后室溫孵育5 min，測定反應液在405 nm處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對照。按照以下公式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

樣品對該兩種酶的抑制率計算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光度；A2為樣品背景組吸光度（以等體積0.1 mol/L、pH6.9磷酸鹽緩沖液PBS替代酶液）；A3為對照組吸光度（以等體積PBS替代樣品液）；A4為對照背景組吸光度（以等體積PBS替代樣品和酶液）。

1.2.3 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用及其結合位點測定 參考并適當修改的Jin等[14]報道的方法測定TP對胰α-淀粉酶熒光猝滅作用。以20 mmol/L PBS（pH6.9）配制濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶溶液，使用0.2 μm水系濾膜過濾后取3份2 mL酶液，分別將其與8 mL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL）混勻，得到混合液1。

參考并適當修改的Wang等[7]報道的方法測定TP對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅作用。以20 mmol/L PBS（pH6.9）配制濃度為0.75 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，將3份1.5 mL酶液分別與1.5 mL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL）混勻后于30 ℃下孵育10 min，得到混合液2。

設置激發波長為280 nm，激發和發射狹縫寬度為5 nm，分別記錄上述2種混合液在300~400 nm范圍的熒光光譜。

TP與酶之間的猝滅效率符合Stern-Volmer方程[15]：

式中：F0和F分別為酶與TP作用前后的熒光強度；[Q]為TP濃度（mol/L）；Ksv為動態猝滅常數；Kq為雙分子猝滅過程速率常數；τ0為無猝滅劑熒光物質的平均壽命，約為10?8s。

TP與酶之間的結合位點數（n）通過以下公式計算：

式中：F0和F分別為酶與TP作用前后的熒光強度；Ka為結合常數；n為結合位點數；C為TP濃度。

1.2.4 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結構的影響 參考并適當修改Wang等[7]報道的方法。分別吸取100 μL的5 mg/mL胰α-淀粉酶和1.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，加入100 μL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL），混勻后于37 ℃孵育15 min，得到待測樣品。采用圓二色光譜儀在190~250 nm范圍內對待測樣品進行掃描，橫坐標為波長（nm），縱坐標為圓二色性（mdeg），繪制色譜圖譜，并計算兩種酶的二級結構含量變化。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

小腸中淀粉的消化先經由胰α-淀粉酶將其水解為麥芽糖、α-極限糊精和少量葡萄糖，然后麥芽糖和α-極限糊精進一步被小腸細胞分泌的α-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。因此，胰α-淀粉酶是淀粉消化的先行條件，其活性高低可影響淀粉消化反應進程。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床用于輔助治療糖尿病的一種有效藥物，可通過減少小腸對消化產物葡萄糖的釋放來降低患者的餐后血糖水平[16]。

TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用如圖1所示。可以看出，隨著TP濃度升高，其對該兩種淀粉消化酶的抑制作用逐漸增大，尤其是對胰α-淀粉酶活性的抑制作用呈現出明顯的劑量依賴關系。該結果與麥麩多糖[17]和番荔枝多糖[18]對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用相似。本實驗中提取的銀耳多糖主要由甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖等單糖構成，并且其阿拉伯糖和木糖含量豐富，該兩種單糖可較好抑制α-葡萄糖苷酶活性[19]。

圖1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of TP on pancreatic α-amylase and α-glucosidase

將TP濃度與其對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率進行擬合，得到擬合方程，計算其50%抑制作用濃度（IC50），結果見表1。可以看出，TP對胰α-淀粉酶的IC50為7.6835 mg/mL，略高于阿卡波糖（5.1870 mg/mL），但明顯低于桑葚多糖[20]（>19.31 mg/mL）；對α-葡萄糖苷酶的IC50為16.9306 mg/mL，顯著（P<0.05）高于阿卡波糖（0.2 μg/mL）。這說明TP是良好的胰α-淀粉酶抑制劑，其對胰α-淀粉酶的抑制作用明顯強于α-葡萄糖苷酶。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率顯著（P<0.05）高于TP，這可能與二者對該酶的結合位點不同有關。α-葡萄糖苷酶上具有與寡糖及雙糖相結合的位點，阿卡波糖結構類似于寡糖，因此可競爭性地與α-葡萄糖苷酶上的結合位點結合而抑制其活性，是一種特異性葡萄糖苷酶抑制劑[21]。TP是一種多糖組分，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用位點不同于阿卡波糖。有關TP與該酶的具體結合位點還有待于進一步探討。

表1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶半數抑制作用濃度（IC50）Table 1 Half maximal inhibition concentrations of TP on pancreatic α-amylase and α-glucosidase (IC50)

綜上所述，TP可抑制胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，并且其對前者的抑制作用明顯強于后者，這樣就能有效抑制淀粉消化的起始速率。

2.2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在賦予淀粉消化酶內源熒光性，其中色氨酸與酪氨酸殘基在280 nm波長時被激發，并且這兩種殘基所處的微環境還會影響其產生的熒光強度與位置[22]。

不同濃度TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶內源熒光強度的影響如圖2所示。在發射波長為300~400 nm時，胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有較強的熒光強度，最大發射峰在340 nm附近。隨著TP濃度增大，該兩種酶的熒光強度逐漸降低，其中胰α-淀粉酶的變化更為顯著，且發生紅移，這與曾傲瓊[23]關于條斑紫菜多糖的研究結果一致。說明胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光主要源于其中的色氨酸和酪氨酸殘基，TP可與胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸殘基發生靜電引力或氫鍵作用，改變胰α-淀粉酶的結構，導致其活性降低，但其對α-葡萄糖苷酶的作用則較微弱[24]。TP與胰α-淀粉酶的相互作用引起酶中色氨酸或酪氨酸殘基的極性變化，微環境由親水性變為疏水性，導致熒光氨基酸殘基發生去折疊和熒光猝滅[25]。此外，隨著TP濃度增加，胰α-淀粉酶的熒光曲線發生了紅移，說明TP對該酶的構象中其它部分也產生了影響。

圖2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用Fig.2 Fluorescence quenching effects of TP on pancreatic αamylase and α-glucosidase

2.3 TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅類型

熒光猝滅作用可分為動態猝滅和靜態猝滅，其中動態猝滅是由于酶與猝滅劑因熱運動相互碰撞而引起。假定TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅作用為動態猝滅，其猝滅常數Ksv為5.3094×1010L/mol，雙分子猝滅過程速率常數Kq為5.3094×1018L/mol·s，遠大于最大碰撞猝滅常數2.0×1010L/mol·s。因此，TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅為靜態猝滅，由此可推斷TP與胰α-淀粉酶可能通過靜電引力或氫鍵等非共價鍵產生相互作用并形成復合物，這可能與TP提高粘度、延緩或減少胰α-淀粉酶與底物淀粉的接觸有關。

2.4 TP與胰α-淀粉酶結合位點數

靜態猝滅是猝滅劑與熒光物質發生相互作用、形成基態的猝滅劑-熒光物質復合物的過程。通過公式計算出TP與胰α-淀粉酶結合位點數n=1.2334，接近1，表明TP與胰α-淀粉酶存在1個結合位點。由于胰α-淀粉酶分子中具有ASP197、GLU233和ASP300多個重要活性位點[26]，因此關于二者具體結合位點尚待進一步研究。

2.5 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結構的影響

圓二色光譜是一種可定量的光譜技術，能靈敏反映蛋白質二級結構的變化，已被廣泛用于蛋白質的構象研究[27]。不同濃度TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結構的影響如圖3所示。可以看出，TP可導致兩種消化酶的圓二色譜峰高和峰形發生變化。其中，胰α-淀粉酶組在200 nm處峰形明顯高于空白組，在215 nm處峰形則明顯低于空白組，而α-葡萄糖苷酶組峰形與空白組相比變化則不明顯。隨著TP濃度的增加，該兩種酶在215 nm處的圓二信號強度增大，胰α-淀粉酶組變化明顯，說明TP的添加對胰α-淀粉酶的二級結構產生了影響，而對α-葡萄糖苷酶二級結構影響不明顯。

圖3 TP與胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的圓二色譜圖Fig.3 Circular dchroism spectra of interactions between TP and pancreatic α-amylase and α-glucosidase

胰α-淀粉酶由496個氨基酸殘基、1個鈣離子、1個氯離子和3個水分子組成[28]，其中100~168號氨基酸組成了8個α-螺旋和8個β-折疊交替出現的（β/α）8的結構模體，且該酶的活性中心位于α-螺旋結構中[29]。采用CDPro軟件處理數據，通過SELCON3算法得到該酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構的相對含量，結果見表2。可以看出，隨TP濃度升高，胰α-淀粉酶中的α-螺旋和β-折疊比例增加，β-轉角和無規則卷曲比例減少。α-螺旋比例逐漸增大，不利于酶活性中心形成，從而限制酶與底物的結合，使其進一步失去活性。這與條斑紫菜多糖[23]對胰α-淀粉酶二級結構影響的研究結果一致。α-螺旋和β-折疊中含有大量氫鍵，二者共同維持蛋白質二級結構的剛性。TP導致胰α-淀粉酶中的β-折疊增多，從而增強酶的剛性[30]。此外，β-轉角和無規則卷曲比例減少則表明酶的柔性減弱。

表2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結構的影響Table 2 Effects of TP on the secondary structures of pancreatic α-amylase and α-glucosidase

由表2可知，加入TP后α-葡萄糖苷酶的各構象比例變化很小，說明TP對該酶構象影響不大。由此推測，TP與α-葡萄糖苷酶的相互作用微弱，對其二級結構影響極小。

3 結論

TP能夠抑制胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，且其對前者的抑制作用顯著強于后者。TP與胰α-淀粉酶的結合位點數為1，二者之間發生了靜態猝滅作用，這種猝滅作用改變了胰α-淀粉酶的二級結構，使其剛性增強、柔性減弱，結構變得更為緊密，影響了酶活性中心的形成，從而抑制了該酶的活性。TP與α-葡萄糖苷酶之間發生了微弱的相互作用，這種作用對該酶的二級結構影響甚微。TP可通過抑制淀粉消化酶的活性影響淀粉的消化，延緩葡萄糖的釋放。本研究結果可為銀耳多糖在降血糖保健食品和藥品中的應用提供理論依據。