基于響應面法和熵權法優化連翹葉中連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取工藝

劉路路，李 可，韋智江，郭 然，趙梓邯，代 熙，李衛東

（北京中醫藥大學中藥學院，中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京102488）

連翹葉是木犀科植物連翹（Forsythia suspensa（Thunb.） Vahl）的干燥葉片。《中華本草》記載“連翹莖葉，性寒，主治心肺積熱”[1]。連翹葉的生物活性成分包括苯乙醇苷類、木脂素類、黃酮類、有機酸類、萜類等化合物[2?3]。現代藥理研究表明連翹葉具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝、降血糖血脂等作用[4?9]。連翹葉生物量大，活性多樣，但由于連翹的主要用藥部位是果實，生產中大量連翹葉被丟棄，目前其開發利用僅限于小部分地區連翹茶的應用，這造成了極大的資源浪費及巨大的經濟損失[10?11]。2017年，國家正式批準連翹葉作為新資源食品，為連翹葉的深度開發利用提供了理論依據和政策支持。

目前連翹葉多采用熱水浸提、回流等效率較低的方法進行提取，而超聲作為一種提取效率高、耗時短、應用范圍廣的方法，在連翹葉上的應用研究較缺乏。此外，連翹葉的提取多針對連翹酯苷A、連翹苷等單一成分[12?15]，有關連翹葉多指標成分的提取工藝研究報道較少。研究表明，連翹葉中連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的含量均高于作為藥材原料入藥的連翹果實中的含量[16]，且具有抗氧化[7,17?19]、抗菌抗病毒[5?6,20]、降血脂[21]、神經保護[22?23]等多種藥理活性，共同構成連翹葉發揮臨床療效的物質基礎。因此本研究以此三個活性成分為指標，采用效率高、時間短的超聲提取法，對提取過程中的關鍵因素，即乙醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度加以考察。并采用熵權法計算連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的相關權重，結合Box-Behnken設計-響應面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM），優選提取工藝，為連翹葉資源的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

連翹葉 2020年8月采自山西省安澤縣，經北京中醫藥大學李衛東研究員鑒定為木犀科連翹屬植物連翹的葉，置通風處陰干，粉碎過4號篩，低溫儲存備用；連翹酯苷A（批號：PS000582）、連翹苷（批號：PS000579） 成都普斯生物科技公司；蘆丁（批號：T27F10Z81699） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇分析純，北京化工廠；醋酸 分析純，北京化學試劑公司；乙腈 色譜純，Fisher Scientific公司；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司。

Waters alliance型高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測器、Empower軟件系統 美國Waters公司；BT25S型1/100000電子分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ型真空泵 上海亞榮生化儀器廠；DFY-200C型搖擺式高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；FD-2A型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC含量測定方法的建立

1.2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1 mL含連翹酯苷A 1.880 mg、連翹苷0.700 mg和蘆丁1.000 mg的混合對照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取連翹葉粉末（過4號篩）1 g，置于50 mL錐形瓶中，于一定乙醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度條件下超聲提取，冷卻后于4 ℃下以8000 r/min轉速離心20 min，移出上清液后定容至100 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，待用。

1.2.1.3 色譜條件 色譜柱：Waters XbridgeTMshield C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）?0.4%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0~8 min，10%~15% A；8~18 min，15%~22% A；18~25 min，22%~40% A；25~30 min，40%~95% A；30~35 min，95% A）；測定波長：277 nm；體積流量：l mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL[24]。

1.2.1.4 線性關系考察 依次稀釋“1.2.1.1”項下混合對照品溶液，分別稀釋2、4、8、16、32倍，甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得系列質量濃度的混合對照品溶液。精密吸取系列不同質量濃度的混合對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以各對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，進行回歸分析。

1.2.1.5 精密度試驗 取“1.2.1.1”項下混合對照品溶液，按“1.2.1.3”項下色譜條件進樣檢測，連續進樣6次。計算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁峰面積的RSD。

1.2.1.6 重復性試驗 取同一批供試品粉末，平行6份。按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1.3”項下色譜條件依次進樣檢測。計算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的提取量及RSD。

1.2.1.7 穩定性試驗 取同一批供試品溶液，按“1.2.1.3”項下色譜條件在0、2、4、6、8、12 h分別進樣測定。計算連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁峰面積的RSD。

1.2.1.8 加樣回收率試驗 取已知各指標成分含量的連翹葉供試品粉末0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入等量的連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁對照品，按“1.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.1.3”項下色譜條件依次進樣檢測，計算得到連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的平均加樣回收率及RSD。

1.2.1.9 指標成分的提取量測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。采用外標法通過標準曲線回歸方程計算各指標成分質量濃度，根據公式計算提取量。

式中：M表示指標成分提取量，mg/g；C表示通過標準曲線回歸方程得到的指標成分質量濃度，mg/mL；100為定容的體積；W表示稱樣量，g。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同乙醇濃度對連翹葉中活性成分提取量的影響 液料比30:1 mL/g，提取時間30 min，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%對連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.2 不同液料比對連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，提取時間30 min，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1 mL/g對連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.3 不同提取時間對連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取溫度60 ℃。在其它條件固定的情況下，考察提取時間10、20、30、40、50 min對連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.2.4 不同提取溫度對連翹葉中活性成分提取量的影響 乙醇濃度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取時間30 min。在其它條件固定的情況下，考察提取溫度20、30、40、50、60 ℃對連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁提取量的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎上，以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為考察因素，各指標成分提取量為評價指標，綜合評分（M）為響應值，利用Design-Expert 11.0.4.0軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計，篩選各因素最優組合條件。試驗因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3 數據處理

每個實驗重復3次，響應面優化分析及方差分析采用Design-Expert 11.0.4.0軟件，作圖采用GraphPad Prism 8.0.1軟件。

采用熵權法對多個指標進行客觀賦權。首先對數據xij根據式1進行歸一化處理，得到歸一化數據再根據式2得到標準化數據pij，再根據式（3）計算第j個指標的信息熵Hj，得到的各指標信息熵根據式4轉化為熵權wj，即得評價指標的熵值。

式中：xij表示第i次試驗時第j個評價指標的提取量值； m in(xi)為第j個評價指標的提取量最小值；max(xi)為 第j個評價指標的提取量最大值；x′ij表示第i次試驗時第j個評價指標的歸一化值；pijij表示第i次試驗時第j個評價指標的標準化值；Hj表示第j個評價指標的信息熵值；wj表示第j個評價指標的熵權值。

2 結果與分析

2.1 HPLC含量測定方法的結果

2.1.1 色譜圖 “1.2.1.3”項色譜條件下對照品及樣品的色譜圖顯示3種指標成分在檢測波長下分離良好，與對照品保留時間相同，見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）與供試品溶液（B）HPLC色譜圖（277nm）Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B) (277 nm)

2.1.2 線性關系 “1.2.1.4”項下得到各指標成分的回歸方程、相關系數（r）及線性范圍，見表2，顯示連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁分別在0.058~1.880、0.022~0.700、0.031~1.000 mg/mL范圍內與色譜峰面積呈良好的線性關系

表2 線性關系考察結果Table 2 Results of linear relationship investigation

2.1.3 方法學考察 “1.2.1.5~1.2.1.8”項下得到的精密度、重復性、穩定性和加樣回收率結果見表3。結果表明精密度和重復性均良好，供試品溶液在12 h內穩定，加樣回收率合格，符合定量分析的要求。

表3 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率結果Table 3 Results of precision, reproducibility, stability and recovery

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同乙醇濃度對連翹葉多指標提取量的影響由圖2可知，連翹酯苷A的提取量隨著乙醇濃度的增加先上升后下降，在乙醇濃度為40%時達到峰值，為63.66 mg/g。而連翹苷和蘆丁的提取量則隨乙醇濃度的增加有較小幅度的增加。這和劉偉霞等[25]的結果基本一致。綜合考慮選擇最佳乙醇濃度為40%，并將其作為響應面試驗研究參數。

圖2 不同乙醇濃度對連翹葉多指標提取量的影響Fig.2 Effects of different ethanol concentration on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.2 不同液料比對連翹葉多指標提取量的影響由圖3可知，三種成分的提取量趨勢基本一致。當液料比增加時，三種成分的提取量先上升后下降或保持平穩。這主要是因為液料比增加，指標成分與溶劑邊界層濃度差變大，成分越容易滲透出來，直至成分在溶劑中的擴散達到了平衡，提取量將不再升高。連翹酯苷A和連翹苷提取量在25:1 mL/g時達到峰值，分別為56.79和20.97 mg/g。蘆丁在20:1 mL/g時達到峰值，為32.17 mg/g。綜合考慮選擇最佳液料比為25:1 mL/g，并將其作為響應面試驗研究參數。

圖3 不同液料比對連翹葉多指標提取量的影響Fig.3 Effects of different liquid-solid ratios on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.3 不同提取時間對連翹葉多指標提取量的影響

由圖4可知，三種成分的提取量變化趨勢較一致，均隨著提取時間的延長而增加。這可能是因為指標成分與溶劑邊界層存在濃度差，超聲時間延長強化了空化和機械效應，有利于有效成分的溶出[26]。三種成分的提取量均在30 min時達到峰值，連翹酯苷A為65.44 mg/g，連翹苷為19.92 mg/g，蘆丁為23.30 mg/g。綜合考慮選擇最佳提取時間為30 min，并將其作為響應面試驗研究參數。

圖4 不同提取時間對連翹葉多指標提取量的影響Fig.4 Effects of different extraction times on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.4 不同提取溫度對連翹葉多指標提取量的影響

由圖5可知，提取溫度對連翹酯苷A提取量影響較顯著，對連翹苷和蘆丁的提取量影響較小。當溫度為50 ℃時，連翹酯苷A提取較完全，為57.88 mg/g。隨著提取溫度的繼續增加，總提取量開始下降，推測其原因可能是連翹酯苷A分子中具有酯鍵，較高溫度易水解[27]。綜合考慮選擇最佳提取溫度為50 ℃，并將其作為響應面試驗研究參數。

圖5 不同提取溫度對連翹葉多指標提取量的影響Fig.5 Effects of different extraction temperature on theextraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.3 響應面試驗結果

根據表4進行Box-Benhnken中心組合實驗設計，共29個實驗點，研究各因素對連翹葉連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁提取量和綜合評分M的影響。響應面試驗設計及結果見表4。

2.3.1 綜合評分（M）計算 本實驗采用熵權法對多個指標進行客觀賦權。熵權法是一種用于衡量指標的離散程度的客觀賦權法，離散程度越大，表明該指標對綜合評價的影響越大[28]，已廣泛應用于提取工藝研究[29?31]。本研究利用信息熵這個工具，計算各項指標的權重，最終計算得到連翹酯苷A、連翹苷及蘆丁的權重值分別為0.2022、0.4204、0.3774。按M=連翹酯苷A提取量×0.2022+連翹苷提取量×0.4204+蘆丁提取量×0.3774，計算不同試驗號下各指標成分綜合評分（M），結果見表4。

2.3.2 模型建立及方差分析 利用Design-Expert 11.0.4.0軟件對表4中綜合評分M進行多元二次回歸擬合，得回歸方程M=30.48+2.98A+1.47B+0.3811C+1.30D?0.6789AB?0.9088AC?0.9716AD?0.0121BC?0.1739BD?0.5509CD?1.97A2?0.5733B2?0.5891C2?2.43D2（R2=0.9472）。對模型進行方差分析，結果見表5。由表5可知該回歸模型極顯著，說明其擬合度及預測性良好；模型的一次項A項、B項、D項極顯著（P<0.01），C項不顯著；交互項均不顯著；二次項A2項和D2項影響極顯著（P<0.01），B2項、C2項不顯著；這表明各因素與綜合評分M間并非簡單的線性關系。失擬項的P值為0.1922>0.05，對綜合評分M影響不顯著，說明該模型的擬合度良好，可以利用該模型確定最優提取工藝條件。

表4 Box-Behnken 響應面試驗設計與結果Table 4 Box-Behnken response surface test design and results

表5 方差分析結果Table 5 Results of ANOVA

2.3.3 響應面分析與優化 利用Design-Expert 11.0.4.0軟件根據模型繪制各因素交互作用對綜合評分M影響的響應面圖，見圖6。響應曲面坡度越大，代表該因素對響應值影響越大。對比圖6響應面圖曲面坡度可知各因素對綜合評分M影響大小為乙醇濃度（A）>液料比（B）>提取溫度（D）>提取時間（C）。根據模型擬合結果，預測連翹葉最優提取工藝為乙醇濃度為50.01%，液料比為28.41:1 mL/g，提取24.98 min，提取溫度為51.01 ℃，綜合評分為31.90。

圖6 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on comprehensive score

2.3.4 驗證實驗 取連翹葉粉末3份，按優選的提取工藝進行處理，考慮實際操作，將提取工藝調整為50%乙醇，液料比為28:1 mL/g，提取25 min，提取溫度為51 ℃。按此工藝條件重復3次，實驗結果見表6。綜合評分的實際值與預測值（31.90）的偏差為0.62%。表明該模型基本準確，響應面分析與熵權法相結合得到的連翹葉提取工藝參數穩定、可靠。

表6 工藝驗證結果Table 6 Process validation results

3 結論

本研究以連翹葉中三種主要活性成分連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的提取量為評價指標，針對乙醇濃度、液料比、提取溫度及提取時間進行單因素考察，并在此基礎上進行響應面試驗優化，得到最佳提取工藝為乙醇濃度：50%，液料比28:1 mL/g，提取溫度：51 ℃，提取時間：25 min。該條件下，連翹酯苷A、連翹苷和蘆丁的提取量分別為69.69、22.87、22.46 mg/g，綜合評分為32.18，符合響應面模型驗證結果。影響提取量的四個因素影響程度大小順序為乙醇濃度（A）>液料比（B）>提取溫度（D）>提取時間（C）。該工藝條件簡單，操作控制容易，穩定性好，為連翹葉的綜合開發利用提供了新途徑。