復(fù)配酶法制備南極磷蝦鮮味酶解液的工藝優(yōu)化

張慶春，余曉婉，相興偉,3，韓 眺，邵天倫，何瀟庭，劉曄峰，丁玉庭,3，劉建華,3，蔡燕萍,3,

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310014；2.國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州），浙江杭州 310014；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；4.浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司，浙江杭州 310024）

南極磷蝦是全球海洋中最大的單種可捕生物資源，其貯存量約為6.5~10.0億噸，近年來日益受到關(guān)注[1?2]。南極磷蝦具有高蛋白[2]、低脂肪[3]、富含礦物質(zhì)元素[4]以及富含DHA、EPA等優(yōu)質(zhì)不飽和脂肪酸[5]的營養(yǎng)特點(diǎn)，也是蝦青素、磷脂、殼聚糖等熱敏性營養(yǎng)物質(zhì)的來源[6]。目前，南極磷蝦通常被加工成南極磷蝦油脂，剩余部分一般被簡單加工成粉狀的動物或水產(chǎn)飼料[7?9]，使得脫脂南極磷蝦粉產(chǎn)品附加值低。目前，對南極磷蝦的深加工與應(yīng)用少有報(bào)道。

南極磷蝦肽具有降血壓、抗氧化、抗疲勞、以及改善老年性骨質(zhì)疏松癥等功效[10?11]，因而具有很大的開發(fā)潛力，但相關(guān)研發(fā)仍然較少。迄今為止，關(guān)于水產(chǎn)品酶法制備酶解液，提高產(chǎn)品可利用價(jià)值的研究報(bào)道屢見不鮮[12?16]。然而，這些報(bào)道側(cè)重研究商業(yè)蛋白酶，如利用風(fēng)味蛋白酶酶解，以水解度或總氮回收率為指標(biāo)，檢測產(chǎn)品的酶解效率，忽略了酶解程度對酶解產(chǎn)物部分滋味的影響。目前，已有多項(xiàng)關(guān)于酶解物呈味研究的實(shí)驗(yàn)，黃百祺等[17]研究了四種龜肉酶解液，發(fā)現(xiàn)呈甜味與苦味的氨基酸具有一定規(guī)律性，吳書建等[18]和于亞輝等[19]發(fā)現(xiàn)魚蝦貝類水解產(chǎn)物中的呈味物質(zhì)主要有核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)離子、肽、游離氨基酸等，其中游離氨基酸和多肽的種類及含量在很大程度上影響酶解產(chǎn)物的風(fēng)味特征，曾晨等[20]篩選出風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶為大黃魚干鮮味肽酶解提取的復(fù)合酶，酶解效率高且所得酶解液分子量集中于鮮味肽相對分子量范圍。1978年，Yamasaki等[21]在經(jīng)過木瓜蛋白酶處理后的牛肉中分離出一種八肽（beefy meaty peptide，BMP），命名為鮮味肽（umami peptide）。自此以后鮮味肽廣受關(guān)注，目前，對鮮味肽的定義為分子量在150~5000 Da之間，由氨基酸組成的一些具有鮮味或增強(qiáng)風(fēng)味的多肽[22]。鮮味酶解液熱量低，天然健康，易于食用，具有很好的開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。

前期研究發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦中鮮甜味氨基酸含量豐富，而目前以鮮甜味游離氨基酸總量為指標(biāo)評價(jià)南極磷蝦蛋白酶解效果的研究尚未見報(bào)道。本研究以酶解效率為指標(biāo)，以感官評價(jià)為手段，通過合理控制酶解時(shí)間及水解度，篩選出一種新型的復(fù)合蛋白酶。借助氨基酸組成分析，以鮮甜味游離氨基酸總量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，制備出一種呈鮮甜味的南極磷蝦酶解液。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂南極磷蝦粉 山東魯華海洋生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（20萬 U/g） 廣州馨之味食品配料商城；胰蛋白酶（4000 U/g） 寧波鼎元食品科技有限公司；菠蘿蛋白酶（5萬 U/g）、堿性蛋白酶（10萬U/g）、胃蛋白酶（10萬 U/g）、中性蛋白酶（10萬U/g）、木瓜蛋白酶（10萬 U/g） 河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司；細(xì)胞色素C（12500 Da）、抑肽酶（6500 Da）、芽孢桿菌（1450 Da）、乙酰丙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、乙基丙氨酸（189 Da） Sigma公司；其他試劑 均為分析級。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；Allegra64R高速冷凍臺式離心機(jī) 美國BECKMAN；電子天平 達(dá)俊電器有限公司；FA1204電子天平 常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；K9840自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日立公司；TSK gel 2000色譜柱（7.8 mm×300 mm，粒徑5 μm，）Waters高效液相色譜儀分析柱，日本Toko Seiki Ltd.；高效液相色譜 美國Agilent Technologies。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝流程 脫脂南極磷蝦粉→控制適當(dāng)料液比→調(diào)節(jié)pH（檸檬酸）→加酶→恒溫酶解→滅酶（沸水浴15 min）→離心（8000 r/min，4 ℃，10 min），過濾取上清→鮮味酶解液。

具體操作步驟：將脫脂南極磷蝦粉用純水控制在一定的料液比后，用檸檬酸調(diào)節(jié)脫脂南極磷蝦液至一定的pH后按照一定的比例添加各類酶，并在一定的溫度下酶解一定時(shí)間，酶解結(jié)束后于沸水浴滅酶15 min。滅酶后的樣品在8000 r/min，4 ℃的條件下離心10 min。離心結(jié)束后取上清液過濾后所得濾液即鮮味酶解液。

1.2.2 外源酶的篩選 以脫脂南極磷蝦粉為原料，選擇7種常見商品外源酶，即風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，并在各自最適酶解條件下（產(chǎn)品廠家提供）進(jìn)行酶解（條件見表1），沸水浴滅酶15 min，終止反應(yīng)過程，冷卻至室溫后，8000 r/min條件下離心10 min，過濾取上清液，通過測定其水解度、多肽得率以及感官評價(jià)比較各酶的酶解效果。

表1 外源酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of exogenous enzymes

1.2.3 多酶復(fù)合酶解配方的選擇 參考吳書建等[18]的外源酶選擇實(shí)驗(yàn)并結(jié)合外源酶篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將優(yōu)選出的外源酶按以下6個(gè)配方進(jìn)行多酶復(fù)合酶解（35 ℃，4 h），以滋味感官評價(jià)和酶解效率為指標(biāo)，確定復(fù)合酶的最佳復(fù)配比例。其中，復(fù)配酶配方：兩種最優(yōu)酶1、酶2按酶1:酶2=1:7、1:15、1:50、1:100、1:150、1:200的添加比例進(jìn)行復(fù)配。

1.2.4 復(fù)合酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 外源酶加酶量的篩選 采用優(yōu)選出的多酶復(fù)合配方，設(shè)置800、1000、1500、2400和3000 U/g五個(gè)水平加酶量，料液比1:4 g·mL?1，pH8.0，35 ℃條件下酶解4 h，以滋味感官評價(jià)和酶解效率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化加酶量。

1.2.4.2 外源酶料液比的篩選 采用優(yōu)選出的多酶復(fù)合配方，2400 U·g?1樣品的加酶量，設(shè)置1:3、1:4、1:5、1:6 g·mL?1四個(gè)水平料液比，pH8.0，35 ℃條件下酶解4 h，以滋味感官評價(jià)和酶解效率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化料液比。

1.2.4.3 外源酶酶解溫度的篩選 采用優(yōu)選出的多酶復(fù)合配方，加酶量2400 U·g?1、料液比1:4 g·mL?1，pH8.0，設(shè)置25、30、35、40、45 ℃五個(gè)酶解溫度，酶解4 h，以滋味感官評價(jià)和酶解效率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化酶解溫度。

1.2.4.4 外源酶酶解時(shí)間的篩選 采用優(yōu)選出的多酶復(fù)合配方，加酶量2400 U·g?1、料液比1:4 g·mL?1，pH8.0，酶解溫度40 ℃，設(shè)置1、2、3、4、5 h五個(gè)水平酶解時(shí)間，以滋味感官評價(jià)和酶解效率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化酶解時(shí)間。

1.2.4.5 酶解pH篩選 采用優(yōu)選出的多酶復(fù)合配方，加酶量2400 U·g?1、料液比1:4 g·mL?1，酶解溫度40 ℃，設(shè)置4.0、5.5、6.5、7.5、8.0五個(gè)水平pH，酶解4 h，以滋味感官評價(jià)和酶解效率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化酶解pH。

1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取加酶量、酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以鮮味肽、鮮味游離氨基酸、多肽得率為指標(biāo)確定最佳酶解工藝。正交試驗(yàn)因素及水平見表2。

1.2.6 感官評價(jià) 參照GB/T 12312-2012 感官分析味覺敏感度測定方法[23]，感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3，從多名人員中篩選出10位感官評價(jià)人員，對酶解液進(jìn)行感官評價(jià)，評定成員每評定一個(gè)樣品前用蒸餾水漱口，取待評定樣品1~2 mL置于口中，10 s后吐出，漱口取參比液品嘗，鮮味參比樣為谷氨酸鈉溶液，濃度0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20 mg·mL?1對應(yīng)的鮮味評分值為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10分，對不同組分進(jìn)行感官評價(jià)。為避免感官評價(jià)人員相互之間會產(chǎn)生主觀影響，評價(jià)人員分開評定。

1.2.7 酶解效率測定

1.2.7.1 多肽得率的測定 取潔凈的培養(yǎng)皿，稱量質(zhì)量m2，將離心（8000 r/min，4 ℃，10 min）過后的蛋白酶解液倒入，再將樣品放入?80 ℃的冰箱中進(jìn)行預(yù)凍3~4 h，冷凍3~4 h后取出放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，待完全干燥后取出并稱量質(zhì)量m1[24]。計(jì)算多肽得率。

式中：m1：干燥后培養(yǎng)皿的總質(zhì)量，g；m2：空培養(yǎng)皿的質(zhì)量，g；M：稱取的脫脂南極磷蝦粉的質(zhì)量，g。

1.2.7.2 水解度（DH）的測定 水解度按照下式計(jì)算：

式中：DH表示水解度，%。

總氮含量根據(jù)國標(biāo)GB 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定[25]中微量凱氏定氮法結(jié)合自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。

氨基態(tài)氮含量參考ZB X 66038-1987 氨基態(tài)氮測定法[26]，略有調(diào)整：吸取5.0 mL酶解液，定容至100 mL，吸取20 mL置于250 mL燒杯中，使用磁力攪拌器，用0.05 mol·L?1NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH8.2。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻，再用0.05 mol·L?1NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗NaOH溶液的毫升數(shù)。同時(shí)取未酶解的蝦粉樣品，做空白試驗(yàn)。

1.2.8 氨基酸組成測定 感官評分受主觀影響因素較大，因此采用高效液相色譜法（HPLC）測定呈味氨基酸，此法對酶解液呈味特征具有較高的靈敏度與重現(xiàn)性[27]。

HPLC操作方法如下：

使用Waters高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，分析柱選用TSK gel 2000色譜柱（7.8 mm×300 mm，粒徑5 μm，），并使用UV檢測器在220 nm下檢測分離的樣品。柱溫保持在30 ℃；流動相為乙腈/水/三氟乙酸（45:55:0.1，v/v）；流速保持在0.5 mL·min?1；進(jìn)樣量為10 μL。標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C；抑肽酶；芽孢桿菌；乙酰丙氨酸-酪氨酸-精氨酸；乙基丙氨酸。由此得到的分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1：

圖1 分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of molecular weight distribution

1.2.8.1 總氨基酸組成測定 準(zhǔn)確稱取酶解液4 g，小心加入水解管中防止掛壁，繼續(xù)加入1:1的分析純鹽酸約6 mol·L?14 mL，氮吹儀吹氮?dú)?5 min后封管。110 ℃水解24 h后，取出冷卻開管。消解后的樣品溶液過濾并定容至100 mL棕色容量瓶中。準(zhǔn)確吸取定容后的樣品2 mL，置氮吹儀上脫酸。溫度60 ℃，脫至干燥。準(zhǔn)確加入0.02 mol·L?1HCl溶液20 mL旋渦器上混勻，取樣品過0.22 μm濾膜過濾小柱，上機(jī)按GB/T 5009.124-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定[28]方法進(jìn)行氨基酸測定。

1.2.8.2 游離氨基酸組成測定 取1 mL酶解液，加入4 mL 5%磺酸水楊酸沉淀多肽及蛋白，用高速冷凍離心機(jī)18000 r·min?1離心30 min，取上清液保存，用0.45和0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析，按GB/T 5009.124-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定[28]方法進(jìn)行氨基酸測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行分析，采用方差分析（ANOVA）比較每組數(shù)據(jù)之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05為顯著性差異），每組樣品做3次平行試驗(yàn)，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源酶的篩選

2.1.1 不同外源酶對酶解液滋味的影響 脫脂南極磷蝦粉經(jīng)7種常見外源蛋白酶分別水解后，其酶解液感官滋味評定結(jié)果如表4所示，添加不同外源酶獲得的各樣品其感官評分存在著明顯差異。這是因?yàn)椋煌傅淖饔梦稽c(diǎn)不同，從而產(chǎn)生不同種類的氨基酸與多肽，不同的氨基酸均有不同的溶解性與味感，因此產(chǎn)生了不同味道的水解蛋白[29]。

表4 不同外源酶處理后獲得的酶解液感官評價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of enzymatic hydrolysate after treatment with different exogenous enzymes

2.1.2 不同外源酶對酶解液水解度和多肽得率的影響 綜合圖2和表4可見，胰蛋白酶酶解液的酶解效率最佳，水解度DH最高可達(dá)到65%，多肽得率49%，但其感官評價(jià)較低。胃蛋白酶酶解液的多肽得率最高，感官評分最佳，但其DH較低。其他五種酶的DH、多肽得率均處于較低水平。單一外源酶作用效果雖各有優(yōu)點(diǎn)，但酶解作用效果有限，各自單獨(dú)作用效果無法同時(shí)達(dá)到滋味和酶解效率最優(yōu)，添加外源酶輔助酶解法可改善酶解滋味及效率。因此，本研究擬采用單酶酶解效果最佳的胰蛋白酶和胃蛋白酶兩種酶復(fù)合進(jìn)行后續(xù)的酶解條件優(yōu)化研究。

圖2 不同外源酶對南極磷蝦蛋白的酶解效果Fig.2 Enzymatic hydrolysis effect of different exogenous enzymes on Antarctic krill protein

2.2 多酶復(fù)合配方的選擇

采用優(yōu)選出的酶1（胰蛋白酶）和酶2（胃蛋白酶），按照1.2.3中的多酶復(fù)合配方酶解脫脂南極磷蝦粉蛋白，其感官評分及酶解效果如圖3所示。由圖3可知，隨著復(fù)配酶比例的增加，DH不斷下降，感官評分不斷提高。配方4（胰蛋白酶:胃蛋白酶=1:100）感官評分的增加值逐漸趨于平緩，DH變化也趨于穩(wěn)定。有研究表明，DH與酶解液的滋味并不呈線性相關(guān)，DH越大，酶解液的感官評分不一定最好，并且隨著DH增加，一些疏水性氨基酸暴露及肽的含量增加，反而影響酶解液的感官滋味[30]。結(jié)合圖3趨勢，本實(shí)驗(yàn)選擇感官評分最優(yōu)，水解度相對較好的配方4為最優(yōu)條件（胰蛋白酶:胃蛋白酶=1:100），并進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 不同比例復(fù)合酶的酶解效果Fig.3 Effect of compound enzymes on the enzymatic hydrolysis at different ratios

2.3 復(fù)合酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 加酶量對酶解液的影響

2.3.1.1 加酶量對酶解液滋味的影響 不同加酶量對酶解液的感官評分，結(jié)果如表5所示，不同外源酶添加量可對滋味造成顯著性影響。1500、2400、3000 U/g樣品加酶量獲得的酶解液感官評分明顯高于其他樣品，擁有較好的感官滋味。

表5 不同加酶量處理?xiàng)l件下的感官評價(jià)結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of different enzyme amounts

2.3.1.2 加酶量對酶解液水解度和多肽得率的影響不同加酶量獲得的酶解液的酶解效率結(jié)果如圖4所示。可發(fā)現(xiàn)隨著加酶量的增加，酶解液的DH和多肽得率均呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢。當(dāng)加酶量大于2400 U·g?1時(shí)，DH逐漸下降，多肽得率增加逐漸趨于平緩。可能由于酶解過程是底物與酶的特異性結(jié)合過程，在底物濃度保持不變的情況下，隨著加酶量的增加，底物與酶接觸的反應(yīng)量增加，加酶量與反應(yīng)速率成正相關(guān)，因此酶解效率大幅度增加。當(dāng)加酶量與底物結(jié)合逐漸趨于飽和狀態(tài)時(shí)，繼續(xù)加酶時(shí)多肽得率漲幅逐漸趨于平緩。同時(shí)，復(fù)配酶之間可能還存在相互作用，在加酶量少時(shí)，相互作用影響不明顯，而加酶量大時(shí)，相互作用明顯，可能造成酶活力降低，導(dǎo)致水解度逐漸下降[31]。加酶量2400和3000 U·g?1的酶解效率、感官滋味均處于較優(yōu)狀態(tài)。但當(dāng)加酶量增加值3000 U·g?1時(shí)，其酶解效率的增長趨勢不如加酶量為2400 U·g?1，故從生產(chǎn)成本考慮選擇2400 U·g?1的加酶量。

圖4 不同加酶量處理?xiàng)l件下的的酶解效果Fig.4 Effect of different enzyme amounts on enzymatic hydrolysis

2.3.2 料液比對酶解液的影響

2.3.2.1 料液比對酶解液滋味的影響 不同料液比對酶解液的感官評分如表6所示，不同料液比對酶解液滋味造成的感官評分結(jié)果影響十分顯著，其中料液比1:4與1:5 g·mL?1，在感官評分上明顯優(yōu)于其他樣品。料液比高于1:6 g·mL?1時(shí)，滋味一般，鮮味較弱，由于加水量多，酶解液被稀釋。料液比1:5 g·mL?1獲得酶解液鮮味值最高（7.8分），但其苦澀味也明顯高于其他料液比。因此，相比而言，在料液比1:4 g·mL?1條件下，酶解液具有更好的感官滋味，在感官滋味評分上獲得較高得分。

2.3.2.2 料液比對酶解液水解度和多肽得率的影響不同料液比對酶解液酶解效率影響如圖5所示。不同料液比之間的DH、多肽得率差異明顯，多肽得率隨料液比的增加而增加，之后逐漸降低，DH隨著料液比增加而降低，漸漸趨于平緩。隨著料液比的增加，相當(dāng)于降低了反應(yīng)體系中的酶濃度及底物濃度，從而使得酶促反應(yīng)速度降低，水解度下降。料液比在1:3 g·mL?1時(shí)雖然水解度最大，但由于水解過程中水量過少，體系過于粘稠，出現(xiàn)結(jié)塊貼壁等現(xiàn)象，導(dǎo)致酶解不充分。而當(dāng)料液比為1:4 g·mL?1時(shí)，其水解度相比于前者下降不多，且多肽得率明顯增加，當(dāng)料液比為1:5 g·mL?1時(shí)多肽得率雖然增加，但DH過低。因此將料液比固定為1:4 g·mL?1，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同料液比對酶解液酶解效率的影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on enzymatic hydrolysis efficiency

2.3.3 酶解溫度對酶解液的影響

2.3.3.1 酶解溫度對酶解液滋味的影響 不同酶解溫度對酶解液的感官評分結(jié)果如表7所示，不同樣品之間滋味存在顯著差異。胰蛋白酶和胃蛋白酶的最適溫度存在一定的差異，不同溫度對酶的反應(yīng)作用具有顯著的影響，從而導(dǎo)致配方4（胰蛋白酶:胃蛋白酶=1:100）對酶解液的酶解效率和滋味產(chǎn)生差異。酶解溫度25與30 ℃獲得的酶解液的感官滋味幾乎相似，在鮮味上無明顯差異，感官評分幾乎一致。因此，該范圍內(nèi)存在具有更好滋味酶解液的最佳酶解溫度。

表7 不同溫度處理?xiàng)l件下的感官評價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results under different temperature treatment conditions

2.3.3.2 酶解溫度對酶解液水解度和多肽得率的影響 不同酶解溫度條件下的酶解效率如圖6所示，隨著溫度升高，DH升高，多肽得率呈先升高后平緩并逐漸下降的趨勢。在25~45 ℃時(shí)，DH隨著溫度的增加而增加，多肽得率隨著溫度的增加先增加而后逐漸降低，在35 ℃時(shí)多肽得率最高，分析可能是由于溫度在低于35 ℃時(shí)，隨著溫度的上升復(fù)合酶酶解效率加強(qiáng)，反應(yīng)速度加快；而超過其最適溫度范圍時(shí)，酶活性降低。綜合感官評價(jià)和酶解效率的綜合得分，選擇酶解溫度為35 ℃。

圖6 不同溫度處理?xiàng)l件下對酶解效率的影響Fig.6 Effect of different temperature treatment conditions on enzymatic hydrolysis efficiency

2.3.4 酶解時(shí)間對酶解液的影響

2.3.4.1 酶解時(shí)間對酶解液滋味的影響 不同酶解時(shí)間對酶解液感官評分如表8所示，不同酶解時(shí)間對酶解液滋味評定具有明顯影響，其中酶解時(shí)間在2、4 h的酶解液具有較好的感官評價(jià)結(jié)果，鮮味適當(dāng)且口感良好，其中酶解4 h相比于2 h鮮味更加明顯。

表8 不同酶解時(shí)間處理?xiàng)l件下的感官評價(jià)結(jié)果Table 8 Sensory evaluation results under different enzymatic hydrolysis time treatment conditions

2.3.4.2 酶解時(shí)間對酶解液水解度和多肽得率的影響 酶解效率如圖7所示，可發(fā)現(xiàn)酶解3 h的樣品DH和多肽得率最高，分別為16%和50%。分析可能是在最初加入外源酶時(shí)，由于底物充足，酶解速度較快，以降解蛋白質(zhì)為主，多肽得率及DH增加迅速，3 h以后隨著酶解時(shí)間增加，底物開始減少，所以蛋白質(zhì)分解速率降低，肽分解速率升高，肽得率降低。綜合表8感官評分結(jié)果得外源酶酶解時(shí)間3 h最佳。

圖7 不同酶解時(shí)間處理?xiàng)l件下對酶解效率的影響Fig.7 Effect of different enzymatic hydrolysis time treatmentconditions on enzymatic hydrolysis efficiency

2.3.5 pH對酶解液的影響

2.3.5.1 pH對酶解液滋味的影響 不同pH對酶解液感官評分如表9所示，不同pH處理?xiàng)l件下對酶解液滋味評定具有明顯影響，其中pH在7.5和8.0時(shí)酶解液具有較好的感官評價(jià)結(jié)果，鮮味適當(dāng)且口感良好，感官評價(jià)結(jié)果表明，復(fù)合酶的最佳酶解pH在7.5~8.0之間。

表9 不同pH處理?xiàng)l件下的感官評價(jià)結(jié)果Table 9 Sensory evaluation results under different enzymatic hydrolysis pH treatment conditions

2.3.5.2 pH對酶解液水解度和多肽得率的影響 由圖8可以看出，當(dāng)pH低于7時(shí)，隨著pH的升高，多肽得率增幅逐漸平緩并出現(xiàn)下降趨勢，DH增長也趨于平緩，pH繼續(xù)增加時(shí)DH無顯著變化（P?0.05）。這可能是由于每種酶都有其最適pH，當(dāng)pH偏小或偏大，酶的反應(yīng)速率都會受到一定程度的抑制，使得酶解不充分[32]。將水解度、多肽得率與酶解液感官評價(jià)結(jié)果綜合分析，確定酶解的最適pH條件為7.5。

圖8 不同pH處理?xiàng)l件下對酶解效率的影響Fig.8 Effect of different pH treatment conditions on enzymatic hydrolysis efficiency

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

氨基酸是蛋白質(zhì)的主要組成成分，食品中氨基酸的種類和含量是衡量其營養(yǎng)質(zhì)量和感官呈味特征的一項(xiàng)重要指標(biāo)[33]，如某些海產(chǎn)品中的特征“肉香”來源于組氨酸[34]。因此選擇肽類氨基酸和游離氨基酸為正交實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行研究。其中呈鮮味的氨基酸主要是天冬氨酸和谷氨酸，呈甜味的主要是絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸，呈苦味的代表性氨基酸主要酪氨酸、組氨酸、精氨酸、纈氨酸[17]。

以鮮甜味游離氨基酸為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析得表10，發(fā)現(xiàn)各因素的影響程度依次為時(shí)間、加酶量、pH、溫度，最佳試驗(yàn)組合為A3B3C1D1，即加酶量2800 U·g?1、溫度40 ℃、pH7.0、酶解時(shí)間2.5 h。以鮮味肽為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，發(fā)現(xiàn)各因素的影響程度依次為加酶量、pH、時(shí)間、溫度，最佳試驗(yàn)組合為A2B2C3D2，即加酶解量2400 U·g?1、溫度35 ℃、pH8.0、酶解時(shí)間3.0 h。以多肽得率為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，發(fā)現(xiàn)各因素的影響程度依次為加酶量、溫度、時(shí)間、pH，最佳試驗(yàn)組合為A3B3C1D2，即加酶量2800 U/g、溫度40 ℃、pH7.0、酶解時(shí)間3.0 h。

表10 脫脂南極磷蝦蛋白水解液的正交試驗(yàn)方案與結(jié)果分析Table 10 Orthogonal experimental scheme and result analysis of defatted Antarctic krill protein hydrolysate

上述三個(gè)組合中，均存在重合的最優(yōu)條件，為使最終產(chǎn)品的該三個(gè)指標(biāo)達(dá)到較優(yōu)水平，認(rèn)為最佳組合即為每組重合的最優(yōu)條件組合。因此，判斷最佳酶解工藝組合為A3B3C1D2，即加酶量2800 U·g?1、溫度40 ℃、時(shí)間3.0 h、pH7.0，所得酶解液的鮮甜味游離氨基酸為331.79 mg/100 mL，鮮味肽為36.04 mg/100 mL，多肽得率為54.5%。

2.5 鮮味脫脂南極磷蝦酶解液的氨基酸組成

考慮實(shí)際需要，對上述工藝條件進(jìn)行了調(diào)整，確定實(shí)際最佳工藝條件為：加酶量2800 U·g?1、溫度40 ℃、時(shí)間3.0 h、pH7.0。在此條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)以考察試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，鮮甜味氨基酸結(jié)果如表11所示，多肽得率為54.5%。

食物的感官風(fēng)味主要來源于食品中的蛋白質(zhì)降解生成的氨基酸或小分子肽，以及其他相關(guān)的衍生物。因此氨基酸的組成對酶解產(chǎn)物的風(fēng)味具有重要影響。南極磷蝦粉在酶解過程中會導(dǎo)致疏水性氨基酸增多，產(chǎn)物苦味增加[35]，鮮甜味氨基酸能掩蓋苦味，因此食物的鮮甜味及苦味與人們是否能接納或排斥該種食物緊密相關(guān)。

從表11可以看出，雖然色氨酸沒有測出，但其余八種必需氨基酸的含量占到了總氨基酸的63.66%，說明酶解液必需氨基酸含量高，具有較好的營養(yǎng)價(jià)值。最佳工藝條件下獲得水解物的游離氨基酸組成中，游離苦味氨基酸占總氨基酸的27.83%，游離鮮甜味氨基酸占總氨基酸26.22%，與鮮味形成具有關(guān)鍵作用的游離谷氨酸和游離天冬氨酸共占總游離氨基酸的10.26%，游離鮮甜味氨基酸含量較高，是酶解液具有良好風(fēng)味的基礎(chǔ)[36]。獲得的水解物總氨基酸組成中，鮮甜味氨基酸占總氨基酸26.09%，苦味氨基酸占總氨基酸的28.39%，ΣEAA/ΣAA與ΣEAA:ΣNEAA分別為63.37%和1.73:1。水解物的總游離氨基酸占總氨基酸的96.14%，總游離苦味氨基酸占總苦味氨基酸的92.46%。游離鮮甜味氨基酸占總鮮甜味氨基酸的96.62%，其中游離鮮味氨基酸占總鮮味氨基酸97.42%，游離甜味氨基酸占總甜味氨基酸的96.12%。

表11 脫脂南極磷蝦酶解液的氨基酸組成（mg/100 mL）Table 11 Amino acid composition of Antarctic krill hydrolysate (mg/100 mL)

同時(shí)，從氨基酸的組成中可以看到，賴氨酸的組成含量較高，賴氨酸是米、面中的第一限制氨基酸。因此可以將南極磷蝦酶解液，添加到有需要的食品中，可以實(shí)現(xiàn)氨基酸互補(bǔ)，從而達(dá)到提高食品的營養(yǎng)價(jià)值。獲得的水解物氨基酸組成營養(yǎng)價(jià)值高，且具有良好鮮甜味滋味，為脫脂南極磷蝦粉進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定了研究基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

單一外源酶作用效果雖各有優(yōu)點(diǎn)，但酶解過程控制不佳會導(dǎo)致酶解液苦澀味偏重，無法同時(shí)使滋味和酶解效率達(dá)到最優(yōu)。不同酶在不同作用時(shí)間對南極磷蝦蛋白水解作用位點(diǎn)不同，因此選用多酶復(fù)合酶解，可優(yōu)化酶解滋味及效果，減少苦味肽與疏水性氨基酸的生成，使得大量鮮甜味氨基酸得以釋放，改善了酶解液的風(fēng)味，提高了南極磷蝦粉蛋白酶解效率。單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了具有良好感官滋味及多肽得率的最佳酶解條件為：加酶量2800 U·g?1，溫度40 ℃，時(shí)間3.0 h，pH7.0，該酶解條件下獲得的酶解液具有良好鮮味，為脫脂南極磷蝦粉的加工利用及深入研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。