EMR固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蝦肉中性激素殘留的方法建立

辛麗娜，莫東淑，蔣定之，曾 堅，梁飛燕，蒙初曦

（廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西南寧 530021）

近年來由于蝦的養殖過程中存在非法過量使用促進生長的性激素等不規范操作，導致蝦肉制品中激素殘留量超標時有發生[1?4]，諸如“激素蝦事件”等，因此蝦肉的性激素殘留量成為社會關注的熱點之一[5?9]。性激素主要是由性腺（睪丸和卵巢）、腎上腺皮質及調控器官產生和分泌的促（抑）性的甾體激素[10]，具有促生長的作用，因此常被用作促進生長劑以加快動物的生長發育，提高飼料的轉化利用率，但性激素由于穩定性強、代謝時間長，蓄積于人們體內會影響正常生理激素平衡，嚴重者將引發癌癥[11?14]。我國在2020年農業農村部250號公告[14]已禁止使用己烯雌酚、甲基睪丸酮、群勃龍等化學合成類激素，并規定這些化合物在食品中不得檢出。盡管如此，由于商業利益驅動，這些禁藥依然屢禁不止[15]。

蝦肉基質復雜、性激素種類繁多，各種類化合物前處理步驟[16?17]不同且復雜，目前檢測性激素前處理的方法有液液萃取法[18]、固相萃取法[19]和超臨界流體萃取法[20?22]等。固相萃取法操作簡單、分離效果好且具有選擇性，廣泛應用于檢測復雜基質的前處理。超高效液相-質譜聯用法[23?26]具有高效液相色譜法和串聯質譜的優點，進一步提升了靈敏度和分離分析效率，簡化前處理步驟，且可在同一時間分析多種化合物等特點，已被廣泛應用于動物源產品及水產品的藥物殘留檢驗[27?28]。

目前，我國有關水產品的性激素檢測的國家檢驗標準有：《農業部958號公告-10-2007水產品中雌二醇殘留量的測定氣相色譜-質譜法》[29]、《SN/T 1980-2007進出口動物源性食品中孕激素類藥物殘留量的檢測方法高效液相色譜-質譜/質譜》[30]、《SC/T 3029-2006水產品中甲基睪酮殘留量的測定液相色譜》[31]、《農業部1163號公告-9-2009動物性食品中己烯雌酚殘留檢測氣相色譜-質譜法》[32]、《SC/T 3020-2004水產品中己烯雌酚殘留量的測定酶聯免疫法》[33]，均為單一化合物檢測。《SN/T 3235-2012出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》[34]對水產品性激素多組分化合物檢測，但此標準對本研究的15種性激素只包括其中2種，因此本研究建立的水產品15種性激素提取方法為首次研究，本研究使用固相萃取法對比兩種SPE萃取凈化柱，對蝦肉樣品的前處理進行方法研究，結合超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜法分析檢測蝦肉中的15種性激素檢測，為水產品性激素多組分檢測研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蝦肉 廣西沿海地區（包括北海市、欽州市、防城港市）共96批，去掉樣品中不可食用部分，取可食用部分，絞碎均質后，?20 ℃冷凍保存，待檢測。

15種性激素標準品：雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、炔諾酮、己烯雌酚、左炔諾孕酮、黃體酮、睪丸酮、甲基睪丸酮、群勃龍、醋酸甲羥孕酮、諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍 純度均大于98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，美國Thermo Fisher 公司；乙二胺四乙酸二鈉、氨水均分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Oasis PRiME HLB （3 mL 60 mg） 美國Waters公司；Captiva EMR-Lipid（3 mL，300 mg） 美國Agilent公司；實驗用水 超純水。

QTRAP 4500液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀美國AB公司；Milli-Q Advantage A10超純水機德國Millipore公司；PGC753e型電子天平 艾德姆衡器（武漢）有限公司；Multi Reax型全自動振蕩器Heidolph公司；X3R型高速冷凍離心機 Thermo公司；Genius NM32LA型氮氣發生器 PEAK公司；ATR Autovap S60型多樣品自動濃縮儀 力德生物科技（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 混合標準儲備液：分別精密稱取15種激素標準物質10 mg（精確至0.1 mg），各置于50 mL容量瓶，加適量的甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為200 μg/mL標準儲備液。移取標準儲備液各5.00 mL，置同一個100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合標準中間液（10.0 μg/mL）。

系列標準工作溶液：分別精密量取適量的混合標準儲備液，用空白基質提取液稀釋，制得到系列標準工作液。

1.2.2 樣品處理 提取：稱取樣品2.5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，渦旋震蕩提取1 min，使樣品被打散，再加入8 mL乙腈，渦旋震蕩提取5 min，使樣品與提取溶劑充分混合后，超聲提取5 min，?2 ℃冷凍離心10000 r/min 10 min，取上清液4 mL待凈化。

凈化：將4 mL上清液轉移至Captiva EMR小柱中，在重力作用下自然洗脫流出，再用1 mL 80%乙腈水沖洗柱子，保持3~5秒每滴流出，同時收集全部流出液與洗脫液，于45 ℃氮吹至近干，用30%乙腈水溶液定容至1 mL，放入超聲波清洗機中超聲提取1 min，0.22 μm微孔濾膜過濾置于進樣小瓶中，待測。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 正離子模式液相色譜條件 色譜柱：CAPCE LLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流動相：A：甲醇，B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件見表1。柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL/min，進樣量：20 μL。

表1 正離子梯度洗脫程序Table 1 Positive ion gradient elution program

1.2.3.2 正離子模式質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI+）；電噴霧電壓（IS）：4500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：30 L/min；霧化氣（GS1）流速：55 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速：55 L/min。

1.2.3.3 負離子模式液相色譜條件 色譜柱：CAPCEL LPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流動相：A：乙腈，B：0.01%氨水溶液，梯度洗脫條件見表2。柱溫：35 ℃，流速：0.4 mL/min，進樣量：20 μL。

表2 負離子梯度洗脫程序Table 2 Negative ion gradient elution program

1.2.3.4 負離子模式質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI?）；電噴霧電壓（IS）：?4500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：35 L/min；霧化氣（GS1）流速：50 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速：50 L/min。

15種激素的定性離子、定量離子與碰撞能量見表3。

表3 15種性激素定性、定量離子和質譜信息Table 3 15 kinds of qualitative and quantitative ion of sex hormone and mass spectrum information

1.3 數據處理

使用MultiQuant3.0.2分析軟件對數據進行定量定性分析。

2 結果與分析

2.1 質譜離子源參數的選擇

本研究測定目標化合物較多，極性相差大，在質譜中的響應差別也較大，要對化合物進行離子源參數優化，將流動相與標準溶液注射泵鏈接，同時將流動相與標準溶液注入質譜儀中。發現雌激素在負離子掃描模式下響應更高，而雄激素和孕激素在正離子掃描模式下響應更高。因此在正、負模式分開掃描下，對質譜的電噴霧電壓、離子源溫度、氣簾氣流速、碰撞能量等一系列參數進行優化，得到了化合物響應值最大時離子源條件見1.2.3，得到最佳質譜條件見表3。質譜圖見圖1、圖2。

圖1 15組分正離子總流圖Fig.1 15 component positive ion total flow diagram

圖2 15組分負離子總流圖Fig.2 15 negative ion total flow diagram of components

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇 分別考察CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H （3 μm，2.0 mm×100 mm） 、CORTECS?UPLC?HILIC （1.6 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent SB-Aq RRHD （1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）、CAPCELLPAK C18 BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）等4 種不同型號色譜柱對相同濃度的標準溶液掃描分析，考察其保留時間和分離效果。結果發現四根柱子中CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）測定正離子項目組分保留時間明顯縮短，分離度更好，測定負離子項目組分的峰型更好，且可在高pH下使用，因此選用CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱進行蝦肉樣品性激素的檢測。

2.2.2 流動相的選擇 在流動相系統選擇中，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.01%氨水（負離子）4組流動相，采用多反應監測模式進行試驗，結果顯示，正離子模式采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時分離度和響應值最高，而負離子模式采用乙腈-0.01%氨水作為流動相時分離度和響應值較高。所以采用多反應監測模式分開對正、負離子進行測定，梯度洗脫時，通過改變流動相的比例，使15種性激素均獲得有效分離，且峰形良好，靈敏度高，利于分辨。

2.3 樣品前處理條件的設計

2.3.1 提取溶劑的選擇 本實驗考察了乙腈、80%乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-2%甲酸乙腈4組溶劑的提取效果，如圖3所示，0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈提取溶液的平均回收率為93.29%，高于乙腈提取溶液，且實驗中發現蝦肉在0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈較易散開，從而提高了結果準確性。因此選擇0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈為提取溶液。

圖3 不同提取劑對15種性激素回收率的影響Fig.3 Effects of different extractants on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.2 凈化條件的選擇 本研究選用Oasis PRiME HLB和Captiva EMR這兩種SPE固相萃取小柱進行凈化效果的對比，通過對比各類化合物回收率來選擇最優的凈化條件。PRiME HLB具有特殊設計的填料，蛋白和磷脂基質干擾去除率可達90%以上，因此有效地保護了色譜柱的使用壽命，且樣品經提取后可直接過柱，簡化了凈化過程。Captiva EMR作為一種新型的固相萃取柱，具有高選擇性的去除脂質基質，且不會造成分析物損失的特點，因此能最大程度減少目標分析物的基質干擾，具有高效的凈化效果。

由圖4可以看出，用EMR柱凈化的回收率比用HLB柱凈化的回收率高，且相對穩定，所以選用EMR作為凈化柱進行樣品凈化。

圖4 不同凈化柱對15種性激素回收率的影響Fig.4 Effects of different purification columns on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.3 固相小柱上樣體積的選擇 實驗還分別考察了樣品離心后的上清液吸取量2、2.5、3、4、5 mL上Captiva EMR過濾柱后回收率的對比，由圖5可以看出，上清液取4 mL時的回收率最高。所以選擇取上清液4 mL轉移至Captiva EMR過濾柱中按1.2.2凈化操作。

圖5 洗脫液體積對15種性激素回收率的影響Fig.5 Influence of eluent volume on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.4 淋洗溶液的選擇 淋洗方式進行了直接收集流出液不進行洗脫、1 mL 80%乙腈水沖洗柱子、2 mL 80%乙腈水沖洗柱子三種方式的對比。

由圖6可以看出，洗脫方式為收集全部流出液后，再用80%乙腈水沖洗柱子比直接收集全部流出液的回收率高，其中1 mL比2 mL的洗脫液回收率數據接近，但1 mL洗脫液回收率較高，因此選用的洗脫液體積為1 mL。

圖6 淋洗方式對15種性激素回收率的影響Fig.6 Influence of rinsing methods on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.5 定容液的選擇 因為定容溶劑可能會使檢測中出現溶劑效應，產生溶劑峰、峰展寬、峰分叉，增加噪音響應并降低化合物的靈敏度等現象，所以樣品經過提取、凈化和氮吹濃縮后,定容溶劑的選擇尤為重要。本研究選擇用乙腈定容，考察了乙腈濃度為10%、20%、30%、40%、50%時回收率的影響。

由圖7可以看出，乙腈濃度為10%、20%、40%、50%時回收率較低，濃度為30%時回收率較高，數據較為平穩，因此選用30%乙腈水為定容濃度。

圖7 定容液對15種性激素回收率的影響Fig.7 Effect of constant volume solvent on recovery of 15 sex hormones

2.4 基質效應

采用UPLC-MS/MS分析樣品時，基質效應是影響定量結果準確性的重要因素。基質效應（ME）是指在樣品測定過程中，由于待測物以外其他物質的存在或其他物理、化學因素直接或間接影響離子化效果，從而影響待測物響應的現象。基質效應的計算公式：其中，Sm和Ss分別表示基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。負的結果表示基質抑制效應，正的結果表示基質增強效應。當ME為?20%~20%時為弱基質效應；ME為?50%~?20%或20%~50%時為中等基質效應；當ME50%時為強基質效應。表4為部分藥物的基質效應。

由表4可以看出，正離子模式下的化合物表現為弱基質效應，負離子模式下的化合物表現為中等基質效應。其中除丙酸睪酮、醋酸甲羥孕酮、苯丙酸諾龍表現為基質增加效應外，其余均表現為基質抑制效應。因此，本實驗采用基質匹配的方法，消除基質效應的影響。

表4 部分性激素的基質效應Table 4 Part of the matrix effect of sex hormones

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線、檢出限和定量限 由于樣品基質復雜，存在基質效應，本實驗采用空白基質溶液稀釋標準溶液，可以消除基質干擾。以目標化合物定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。稱取2.5 g蝦肉樣品空白基質，分別加入混合標準溶液按1.2.2方法處理樣品，制得質量濃度分別為1、2、5、10、20、30、50 μg/kg的基質混合標準曲線。以3倍信噪比（S/N=3）對應的空白樣品添加質量濃度作為檢出限（limit of detection, LOD），10倍信噪比（S/N=10）為定量限（limit of quantitation，LOQ）。15種性激素的線性方程、線性范圍、相關系數見表5。

表5 15種性激素的線性方程、線性范圍和相關系數Table 5 Linear equation, linear range and correlation coefficient of 15 sex hormones

本實驗在線性范圍內，相關系數r均大于0.99，線性良好，檢出限范圍0.0015~0.436 μg/kg， 定量限范圍是0.0051~1.453 μg/kg。

2.5.2 方法回收率和精密度 為評價分析方法的準確性和可靠性,考察了蝦肉樣品的空白基質在2、4、40 μg/kg加標濃度下15種藥物的回收率，每個加標濃度平行測試6次，外標法定量，計算平均回收率與精密度。結果表明，15種藥物的平均加標回收率為85.31%~119.84%，相對標準偏差為2.11%~9.86%，見表6。

表6 15種性激素的平均加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 6 Average spiked recovery and relative standard deviation of 15 sex hormones

3 結論

本研究建立EMR固相萃取高效液相色譜-串聯質譜法測定蝦肉中15種性激素的檢測方法。通過設計前處理方法的提取溶劑的選擇、凈化條件的選擇：對比了Oasis PRiME HLB和Captiva EMR的凈化效果、淋洗溶液的選擇、定容液的選擇、如何更好消除基質效應等。結果顯示，1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉-乙腈是最合適的提取試劑，Captiva EMR柱的凈化效果最佳，取4 mL上清液過柱后，1 mL 80%乙腈淋洗，30%乙腈定容的提取方法在1~50 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r）均大于0.99，方法檢出限為0.0015~0.436 μg/kg，定量限為0.0051~1.453 μg/kg，平均回收率在85.31%~119.84%，相對標準偏差為2.11%~9.86%（n=6）。本方法簡單快速，為食品檢測機構檢測應對大批量蝦肉中多組分性激素檢測提供了技術參考。