基于保留指數(shù)的草莓中殺菌劑快速測定方法建立

姚雪漫，張秋萍, ，蔣建榮，羅 佳，吳春霞，馬曉艷

（1.蘇州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇蘇州 215004；2.江蘇省食品安全風(fēng)險監(jiān)測重點實驗室（非法添加領(lǐng)域）， 江蘇蘇州 215004）

草莓外觀靚麗、香味誘人、口感酸甜多汁，富含氨基酸、胡蘿卜素、維生素、鈣、鐵等營養(yǎng)素，廣受消費者的喜愛。草莓種植周期短、經(jīng)濟效益大，為我國“三農(nóng)”發(fā)展做出了巨大貢獻，自2003年起，中國的草莓種植面積、草莓產(chǎn)量均位居世界第一[1]。但是在草莓栽培過程中，病害問題易發(fā)，如：炭疽病、白粉病、灰霉病、輪紋病、黑斑病等，殺菌劑的使用無可避免[2?3]。截止2021年6月24日，國內(nèi)登記在草莓上使用的有效期內(nèi)殺菌劑共有不同企業(yè)生產(chǎn)的90個農(nóng)藥制劑[4]，涉及30余種農(nóng)藥有效成分，其中嘧菌酯、嘧霉胺、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑、啶酰菌胺等在多地的草莓農(nóng)殘監(jiān)測中檢出率較高，在登記范圍之外的腐霉利、異菌脲、甲霜靈等農(nóng)藥殘留亦有較多檢出[5?6]。草莓無果皮保護，其果肉會與殺菌劑直接接觸，從而導(dǎo)致草莓膳食風(fēng)險增大，食品安全問題引發(fā)多方關(guān)注[7?8]。于今年9月3日實施的最新版《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》GB2763-2021規(guī)定了100余項草莓相關(guān)農(nóng)藥的最大殘留限量，均為國家監(jiān)管部門抽查監(jiān)督時重點關(guān)注對象。本文綜合考慮近年來農(nóng)藥殘留監(jiān)測中檢出率較高、GB2763-2021標(biāo)準(zhǔn)涉及、以及國外農(nóng)殘限量要求等多重因素，篩選出32種草莓常用殺菌劑建立快速檢測方法，為監(jiān)管部門準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)食品中存在的安全隱患提供有力的技術(shù)支持，保障人民群眾“舌尖上的安全”。

已有研究中，采用氣相色譜單級質(zhì)譜檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)草莓中數(shù)十種殺菌劑同時測定，但方法定量限普遍較高，崔淑華等[9]建立了大蔥及草莓中49種殺菌劑殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜法測定方法，此方法中部分殺菌劑定量限超過20 μg/kg；Yang等[10]采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定了漿果中88中農(nóng)藥殘留，其方法定量限在15~20 μg/kg之間，高于日本肯定列表“一律標(biāo)準(zhǔn)”的0.01 mg/kg（10 μg/kg），且單級質(zhì)譜的分別率較低，易受相近離子干擾；侯雪等[11]報道了21種草莓殺菌劑殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其通過對各標(biāo)準(zhǔn)品的全掃描來鎖定母離子、子離子，并逐一優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，方法建立過程較為繁瑣、耗時，限制了殺菌劑檢測的數(shù)量，且個別殺菌劑的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差接近18%；齊沛沛等[12]采用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測了草莓中腈菌唑、苯醚甲環(huán)唑等九種常見殺菌劑，該定量方法的建立亦需單獨優(yōu)化各農(nóng)藥分析條件，限制了殺菌劑的檢測數(shù)量和效率，且液相色譜串級質(zhì)譜儀器成本較高，普適性略差。

現(xiàn)有國內(nèi)外文獻及國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范中，在建立多農(nóng)殘同時測定方法時，大多需要使用單組分標(biāo)準(zhǔn)品對化合物的質(zhì)譜參數(shù)進行逐一優(yōu)化和選擇[12?17]，人員的工作量大，且測定的農(nóng)殘數(shù)量被限制，難以適應(yīng)安全監(jiān)管、風(fēng)險監(jiān)測等規(guī)模大、時間緊的檢測工作要求。對此，氣相色譜的保留指數(shù)原理可以被合理利用以提高工作效率。保留指數(shù)（retention index）是指用于氣相色譜法的一種定性參數(shù)，表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，且設(shè)定正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為其碳數(shù)的100倍。理論上，化合物的保留指數(shù)只和化合物本身的性質(zhì)以及色譜柱的固定相有關(guān)，與色譜條件以及色譜柱的長度、內(nèi)徑均沒有關(guān)系，發(fā)展至今，各種氣相色譜保留指數(shù)通用數(shù)據(jù)庫資源豐富[18?19]，可應(yīng)用于不同氣相色譜儀器上。基于保留指數(shù)原理，目前已建立起了在復(fù)雜基質(zhì)中定性目標(biāo)化合物[20]的方法，比如酸奶[21?22]、豆?jié){[23]、調(diào)料[24]等食品中揮發(fā)性成分鑒定，香精香料[25]中香氣成分分析，中藥[26]揮發(fā)油成分定性等。然而，農(nóng)殘檢測不僅需要定性，更要求獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果以示權(quán)威，文獻中利用保留指數(shù)原理所建立起的定量檢測方法有蔬菜中有機磷[27]、植物性食品中部分農(nóng)殘[28]、八角茴香中菊酯[29]，所測定的目標(biāo)化合物存在種類單一，且草莓中常用殺菌劑腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑等尚未有保留指數(shù)方法建立。

本研究利用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液的全掃描數(shù)據(jù)和待測化合物的保留指數(shù)，計算出待測化合物的當(dāng)前保留時間，以快速建立起草莓中32種殺菌劑的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測方法，為草莓質(zhì)量安全風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。本方法旨在建立一種無需逐一掃描單組分標(biāo)準(zhǔn)品進行離子確認(rèn)和參數(shù)優(yōu)化，較常規(guī)方法更為高效、簡便、快速，且目標(biāo)化合物的檢出限和定量限能夠完全滿足國內(nèi)國際各項標(biāo)準(zhǔn)要求的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QuEChERS耗材包 包括鹽包（MgSO4/NaCl/Na Citrate/Sodium dihydrogen citrate，4000 mg/1000 mg/1000 mg/500 mg）、15 mL塑料管（MgSO4/PSA，900 mg/150 mg）、石墨碳黑，BESEP公司；陶瓷均質(zhì)子 CNW公司；1000 μg/mL C9~C33正構(gòu)烷烴混標(biāo)Bepure公司；100 μg/mL環(huán)氧七氯B、50 μg/mL殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)品 Bepure公司；乙腈、乙酸乙酯、正己烷 色譜純，默克公司；供試草莓樣品 分別自路邊水果店、農(nóng)貿(mào)市場、超市、網(wǎng)購四種渠道采購，在?4~0 ℃環(huán)境中冷藏保存。

GCMS-TQ8040氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 島津公司；八孔臺式離心機 熱電公司；NEVAP112自動氮吹濃縮儀 Capiler Life Science公司；KB-5010試管振蕩器 中國其林貝爾有限公司；QT-1渦旋混合器 上海琪特分析儀器有限公司；HR2195攪拌機 飛利浦公司；AX204電子分析天平 Mettler-Toledo公司；各量程移液槍 Gilson公司；Milli-Q純水儀 Millipore公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用乙酸乙酯將50 μg/mL殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成500 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并進一步稀釋成100 μg/L和1 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液，用乙酸乙酯將環(huán)氧七氯B稀釋至5 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷將C9~C33正構(gòu)烷烴混標(biāo)稀釋至5 μg/mL，均保存于0~4 ℃冰箱中；綜合考慮儀器的靈敏度、待測殺菌劑的限量及報道檢出濃度[5?6]等，用空白草莓基質(zhì)配成濃度為5、10、50、100、200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所購殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液包含本研究涉及的32種目標(biāo)成分；待檢溶液中加內(nèi)標(biāo)濃度為100 μg/L。

1.2.2 樣品溶液配制 用攪拌機將草莓樣品粉碎并攪拌均勻，取粉碎過的草莓樣品10 g于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈、QuEChERS耗材包的鹽包、1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，在試管振蕩器上劇烈振蕩30 min，以4500 r/min常溫離心5 min；吸取6 mL上清液至QuEChERS耗材包的15 mL塑料管中，并加入15 mg石墨炭黑，劇烈振蕩30 min，以4500 r/min常溫離心5 min；吸取2 mL上清液至10 mL試管中，氮吹至近干，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液、1 mL乙酸乙酯復(fù)溶，渦旋2 min，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，以10300 r/min常溫離心5 min，吸取上清液至進樣瓶。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃，進樣量1.0 μL，不分流進樣，載氣為高純氦氣，高壓進樣壓力為49.7 kPa，載氣控制方式為恒線速度模式，色譜柱流量為1.0 mL/min，線速度為36.1 cm/s；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，再以12 ℃/min升至300 ℃，保持1 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 正構(gòu)烷烴掃描時采用Q3 SCAN模式，其余全部采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源為電子轟擊源，離子化能量7 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜傳輸接口溫度280 ℃，碰撞氣為氬氣，檢測器電壓相對于調(diào)諧結(jié)果+0.6 V，溶劑延遲時間為3 min；定量參考離子允許偏差<30%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文采用島津GCMS-TQ8040氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀的實時分析軟件和再解析軟件分別進行數(shù)據(jù)譜圖的采集和處理。在2.1中的方法建立后，首先，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各濃度點由低到高順次進樣，采集數(shù)據(jù)后，在再解析軟件中建立各殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并自動計算各相關(guān)系數(shù)；隨后，進行方法驗證相關(guān)實驗，通過低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進樣計算檢出限定量限、空白溶液加標(biāo)重復(fù)實驗進行精密度準(zhǔn)確度驗證實驗等，所涉及實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和計算在Excel 2017版本軟件中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法建立

將5 μg/mL C9~C33正構(gòu)烷烴混標(biāo)在1.3儀器條件下進樣并采集數(shù)據(jù)，在再解析軟件中識別C9~C33正構(gòu)烷烴各自的峰并保存數(shù)據(jù)文件，將該數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Smart Datebase Pesticides數(shù)據(jù)庫，自動計算并生成含目標(biāo)化合物預(yù)測保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)等信息的方法文件，使用該方法對100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液進行檢測，獲得各組分的實際保留時間，詳細(xì)信息見表1，無需使用單組分標(biāo)準(zhǔn)品即可確定方法參數(shù)。32種殺菌劑的預(yù)測保留時間和實測保留時間非常接近，時間差均小于0.05 min，在儀器數(shù)據(jù)分析軟件中可以進行定性識別。

表1 32種殺菌劑的定量離子對、定性離子對、碰撞電壓、預(yù)測保留時間和實際保留時間Table 1 Quantitative ion pair, qualitative ion pair, collision voltage, the predicted retention time and the actual measured retention time of 32 fungicides

2.2 方法的線性范圍和定量限

將草莓樣品按1.2.2中方法制備成樣品溶液，選用空白草莓基質(zhì)配成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)化合物峰面積對其濃度作線性回歸，各殺菌劑在所分析的濃度范圍具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.9982；將1 μg/L低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)進樣10次，所測得信號平均值進行計算，以三倍信噪比（S/N≥3）確定方法檢出限（LOD）為0.01~2.91 μg/kg，以十倍信噪比（S/N≥10）確定方法定量限（LOQ）為0.04~9.71 μg/kg（見表2），低于國標(biāo)方法GB23200.113《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留的測定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》中的定量限10 μg/kg，能滿足國內(nèi)外對草莓中相應(yīng)農(nóng)藥殘留測定的要求。盡管國內(nèi)登記在草莓上使用的殺菌劑涉及30余種農(nóng)藥成分，但在國內(nèi)報道文獻中，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法所建立起的草莓中多種殺菌劑同時檢測的方法較少[11,16]，同時測定的殺菌劑數(shù)量也較少；而采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法所建立的方法[12,30?31]，所用儀器設(shè)備昂貴，實驗成本高，且與本研究中涉及的殺菌劑種類有所差異。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

采用空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，分別對10、50、100 μg/kg三個水平進行加標(biāo)回收率實驗，每個添加水平測定6次，得到該方法三個水平的回收率分別在73.3%~115.9%、70.4%~113.4%、70.3%~117.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.4%~8.1%、0.05%~7.0%、0.01%~8.5%之間，方法的準(zhǔn)確度和精密度在可接受范圍內(nèi)，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好（見表2）。

表2 32種殺菌劑相關(guān)系數(shù)（r），檢出限，定量限，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Correlation coefficient (r), LODs, LOQs, recoveries and RSDs of the 32 fungicides (n=6)

2.4 草莓樣品測定

分別從A路邊水果店、B農(nóng)貿(mào)市場、C超市、D網(wǎng)購四種渠道采購草莓樣品，各均分兩份。通過簡單調(diào)查，選擇兩種最常用的方式對所購草莓進行清洗，操作如下：方式一，用自來水沖洗表面后，去除草莓蒂；方式二，用自來水沖洗表面并去除草莓蒂后，自來水浸泡10 min，再沖洗一遍。依次將樣品編號A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2，所有樣品均取平行樣檢測，按照1.2.2中方法制備樣品溶液，上機測試，結(jié)果見表3。其中，有檢出的殺菌劑為腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑，但均未超過國家限值（見表4）。相比于僅用自來水沖洗，經(jīng)過10 min浸泡的草莓所檢出殺菌劑的濃度減少20%以上，圖1為B1和B2兩個樣品的TIC對比圖，經(jīng)過10 min自來水的浸泡，草莓中腐霉利、啶酰菌胺和腈菌唑的含量明顯減少。基于上述對比實驗結(jié)果，消費者清洗草莓時，去蒂后用清水浸泡一段時間再沖洗能夠減少殺菌劑殘留，可避免一定膳食風(fēng)險。

表3 草莓樣品中32種殺菌劑殘留測定結(jié)果（μg/kg, n=3）Table 3 Determination results of 32 fungicides in strawberry samples (μg/kg, n=3)

表4 草莓中腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑四種殺菌劑的國內(nèi)外最大殘留限量[32]Table 4 Procymidone, boscalid, myclobutanil, tetraconazole maximum residue limits of strawberry in China, EU and US[32]

圖1 B1（a）和B2（b）供試樣品溶液TIC圖Fig.1 TIC chromatograms of B1(a) and B2(b) test solution

續(xù)表 2

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS前處理方法，并基于保留指數(shù)原理建立起氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用的快速測定方法，可以同時完成草莓中32種常見殺菌劑殘留的定性定量分析。在方法建立時，通過正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μg/L殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液兩次進樣即可獲取各組分保留時間并生成質(zhì)譜參數(shù)方法文件，快速、高效，應(yīng)用潛力大；方法驗證實驗中，各殺菌劑在所分析的濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r>0.9982，檢出限為0.01~2.91 μg/kg，定量限為0.04~9.71 μg/kg，在10、50、100 μg/kg三個水平的加標(biāo)回收率分別在73.3%~115.9%、70.4%~113.4%、70.3%~117.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.4%~8.1%、0.05%~7.0%、0.01%~8.5%之間，準(zhǔn)確度和精密度在可接受范圍內(nèi)；在草莓樣品測定中，腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑四種殺菌劑有檢出，均未超過國家限值；通過簡單對比實驗比較了兩種草莓清洗方式，發(fā)現(xiàn)去蒂后用自來水浸泡一段時間再沖洗能夠減少殺菌劑殘留，避免一定膳食風(fēng)險。本研究所建立方法的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度良好，適用于市售草莓32種常見殺菌劑檢測，較現(xiàn)有文獻報道[11,16]，擴大了草莓中殺菌劑的同時測定數(shù)目，有效降低了工作量，提升檢測效率，在農(nóng)殘檢測中具有重要的應(yīng)用價值。