頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用法對3種洋蔥揮發性風味成分的分析

王 蓉，曾文錦，劉 盼，周 麗，任興權，楊雪芬，趙 俊

（酒泉市食品檢驗檢測中心，甘肅酒泉 735000）

洋蔥（Allium cepaL.）是蔥科最廣泛種植和食用的蔬菜之一，因其具有特殊的風味和辛辣的口感，被用作香料和食品配料。洋蔥含有的營養成分有蛋白質、碳水化合物、維生素、礦物質、膳食纖維、半胱氨酸衍生物和酚類化合物等[1]，除此之外還具抗真菌、抗病毒、抗炎、抗高血壓、抗糖尿病、抗過敏和降血脂等多方面的藥理與抗菌特性[2?3]。

洋蔥的所有藥用特性主要與其揮發性化合物有關，而這些揮發性化合物主要是以半胱氨酸衍生物形式存在的含硫化合物[4?5]。洋蔥的含硫化合物大多數具有揮發性，因此洋蔥含有的揮發性成分的種類和含量是洋蔥的主要品質特征之一，更是洋蔥商品價值的重要參考[6]。Colina-Coca等[7]分析了洋蔥的揮發性成分，發現洋蔥的主要揮發性成分為二硫化物、三硫化物和醛類化合物。Choi等[8]利用HS-SPMEGC-MS聯用法對洋蔥的揮發性化合物進行了分析，得知新鮮洋蔥中的主要揮發性化合物為二丙基二硫。孫雪君等[9]利用HS-SPME-GC-MS聯用法對不同品種洋蔥的揮發性化合物進行了分析對比，發現紅皮鮮洋蔥和白皮鮮洋蔥的揮發性成分主要是含硫化合物、醛類、醇類。但是，到目前為止，對洋蔥揮發性成分的固相微萃取條件的優化還未見有相關文獻報道，對三種不同色澤洋蔥揮發性成分分析和對比的研究相對較少。

頂空固相微萃取（headspsce-solid-phase microextraction，HS-SPME）是近年來新興的一種集樣品采集、富集、進樣為一體的揮發性成分提取方法，樣品處理過程快速、簡便，不需要加入提取溶劑，屬于環境友好型樣品處理方法[10]，該方法已經被廣泛用于食品[11?13]、環境[14]、醫藥[15]等樣品中揮發性成分的前處理。本文就影響固相微萃取效率的萃取纖維頭、萃取溫度、萃取時間、解吸時間等因素進行了優化，利用較優的固相微萃取條件，分析測定三種不同色澤洋蔥中的揮發性化合物，對比分析三種色澤洋蔥揮發性成分的差異，為洋蔥精深加工提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白皮洋蔥（品種為白碧龍）、紅皮洋蔥（品種為紅優1號）、黃皮洋蔥（品種為金稞7號） 三種色澤洋蔥均于2021年8月采集于甘肅省酒泉市肅州區《地理標志產品 酒泉洋蔥》地理標志產品保護范圍內；NaCl（分析純） 北京北化精細化學品有限公司。

CMS-QP2010 PLUS氣相色譜質譜聯用儀 日本島津公司；HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm） 美國安捷倫公司；頂空固相微萃取進樣手柄，50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、85 μm Polyacrylate、60 μm PEG、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）固相微萃取纖維頭 美國Supelco公司；加熱型磁力攪拌器 美國TALBOYS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品準備 選擇無損傷、無腐爛的洋蔥，洗凈后剝皮、切分，取50 g左右洋蔥粒于研缽中，加液氮迅速研磨成粉末后置于?4 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.2 萃取過程 參照Fernandes等[16]的方法，準確取10 g洋蔥粉末于頂空瓶中，加入飽和NaCl溶液5 mL，放入磁力攪拌子，封蓋后搖勻，將頂空瓶置于磁力攪拌儀上，在1600 r/min的轉速下攪拌和加熱，恒溫20 min，使揮發性物質在頂空瓶的樣品上方達到平衡。將老化處理的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭，在一定溫度條件下吸附一定時間，抽回纖維頭并拔出萃取頭，迅速將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，推出纖維頭，在250 ℃條件下解析一定時間，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數據。

1.2.3 HS-SPME條件優化

1.2.3.1 萃取纖維頭優化 萃取纖維頭每次使用前需要老化，利用進樣手柄分別將50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、60 μm PEG、85 μm Polyacrylate萃取纖維頭在進樣口溫度為260、250、300、280、250 ℃條件下老化1、0.5、1、1、0.5 h。將老化好的萃取頭插入頂空瓶中樣品上方，推出纖維頭，在40 ℃條件下吸附40 min，萃取完成后，將萃取纖維頭置于氣相色譜儀進樣口解吸5 min時間，同時啟動儀器采集數據。每次實驗至少重復3 次。

1.2.3.2 萃取條件優化 在頂空瓶中稱取10 g樣品，加入飽和NaCl溶液5 mL，將老化好的5種不同涂層的萃取纖維頭分別插入平衡后的頂空瓶中萃取，60 ℃加熱條件下萃取60 min，將萃取頭插入儀器進行分析，根據總離子流色譜圖確定總峰面積和化合物個數，選擇最佳的萃取纖維頭。然后經單因素實驗考察萃取時間、萃取溫度、解吸時間，考察范圍分別為萃取時間10~80 min、萃取溫度20~80 ℃、解吸時間3~7 min，以總峰面積與化合物個數為指標，確定各因素最佳水平。每次實驗至少重復3 次。

1.2.4 GC-MS條件 GC條件：色譜柱為HP-INNOWAX型號的毛細管柱，規格為60 m×0.250 mm×0.5 μm；氣相色譜儀進樣口溫度為250 ℃；程序升溫條件：初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min的速率升溫至180 ℃，不保持，再以20 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%）；柱流量0.98 mL/min；分流比20:1。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描模式：全離子掃描（Full San）；離子質量掃描范圍：m/z 25~500 u。

1.3 數據處理

樣品中各揮發性成分的定性由計算機檢索與NIST標準質譜庫匹配求得；揮發性成分的定量由計算機數據處理系統，按照峰面積的歸一化方法進行定量分析，計算相對含量。采用利用Excel 2010作圖，IBM SPSS Statistics 20軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME纖維頭的選擇

本文選擇5種不同極性的萃取頭對洋蔥的揮發性成分進行測定，經GC-MS分離檢測，如圖1所示，5種萃取頭對洋蔥揮發性成分萃取效果有明顯差異，100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate、60 μm PEG和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對洋蔥樣品揮發性物質的萃取效果明顯優于75 μm CAR/PDMS，前四者化合物個數明顯多于CAR/PDMS萃取頭，且相互之間無明顯差異，DVB/CAR/PDMS、PDMS、Polyacrylate、PEG峰面積逐漸遞減，DVB/CAR/PDMS萃取的化合物峰面積最大，表明DVB/CAR/PDMS對洋蔥揮發性化合物的萃取最有效。這可能是由于DVB/CAR/PDMS是三相萃取纖維頭，包含了極性和非極性材料，能夠更全面地分析揮發性化合物[17]。綜合考慮，本實驗確定50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭進行后續實驗。

圖1 萃取纖維頭對洋蔥揮發性物質的萃取結果的影響Fig.1 Effect of different extraction fibers on extraction efficiency of volatile substances from onion

2.2 HS-SPME單因素實驗結果

2.2.1 解析時間的選擇 由圖2可知，隨著解吸時間的延長，洋蔥揮發性化合物總峰面積和揮發性化合物個數變化不大。解吸時間為3~5 min，揮發性化合物個數逐漸增大，為81個，而峰面積在呈現略微減小后有增大的趨勢，在5 min時總峰面積為8.2×109。而解吸時間在5~7 min檢測出的峰個數和峰面積呈現下降趨勢，這可能是因為揮發性化合物在高溫下解吸時間過長會使一些成分發生氧化、異構等反應[18]。因此，本實驗確定的解吸時間為5 min，即萃取頭在進樣口保持5 min使吸附在萃取頭上的揮發性成分解吸下來之后打開吹掃閥吹掃掉多余物質。萃取纖維頭在進樣口解吸之后多停留2~3 min，以盡量減少萃取纖維頭上干燥物質的殘留。

圖2 解吸時間對洋蔥揮發性成分的影響Fig.2 Effect of desorption time on detection of volatile components of onion

2.2.2 萃取時間的選擇 如圖3所示，在萃取溫度為40 ℃時，隨著萃取時間的延長，總峰面積及揮發性化合物個數都呈增加趨勢，萃取時間在60 min時，總峰面積和揮發性化合物個數均達到最大，此時共檢測出89種揮發性化合物，總峰面積為9.4×109。在60 min之后，總峰面積基本趨于平穩，揮發性化合物個數略有下降。這可能是由于在達到萃取平衡前，萃取纖維頭的吸附量隨著萃取時間的延長而增加，當萃取體系中被萃取物和萃取纖維頭固定相之間達到飽和后，萃取纖維頭的吸附量不再隨時間延長而改變[19]。

圖3 萃取時間對洋蔥揮發性風味物質的影響Fig.3 Effect of extraction time on detection of volatile flavor substances of onion

2.2.3 萃取溫度的選擇 如圖4所示，萃取時間在60 min條件下，隨著萃取溫度的升高，揮發性化合物個數總體趨勢呈平穩增長，在60 ℃時達到最大值，共檢出揮發性化合物103種，總峰面積隨著萃取溫度的升高變化不大，在60 ℃時也達到最大值，此時總峰面積為1.1×1010。這是由于隨著萃取溫度的升高，洋蔥中揮發性化合物的擴散速度隨之增大，從而提高了揮發性化合物的萃取效率，但是溫度過高又會導致吸附在萃取頭上物質的解吸與分解[20]。Brodnitz和Carson研究發現溫度對蒜氨酸酶的活性有敏感影響，溫度過高會導致蒜氨酸酶變性，使洋蔥失去其辛辣的揮發性風味，并導致代謝的生物揮發性化合物的減少[21?22]。綜上所述，選擇60 ℃為最佳萃取溫度。

圖4 萃取溫度對洋蔥揮發性成分的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on detection of volatile components of onion

2.3 洋蔥揮發性成分分析

利用優化出的較優萃取條件對三種色澤洋蔥的揮發性成分進行分析，得到白皮洋蔥、紅皮洋蔥和黃皮洋蔥的揮發性成分總離子流色譜圖，如圖5~圖7所示。經過NIST 17譜庫檢索識別化合物，利用峰面積歸一化法生成各揮發性物質組分的相對含量，得到不同色澤洋蔥的揮發性化學成分種類及相對含量見表1、表2。

圖5 白皮洋蔥中揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatograms of volatile components in white onion

圖7 黃皮洋蔥中揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.7 Total ion current chromatograms of volatile components in yellow onion

表2 各樣品揮發性化學成分物質種類及其含量比較Table 2 Comparison of types of volatile compounds and their relative contents in onion

圖6 紅皮洋蔥中揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion current chromatograms of volatile components in red onion

三種色澤洋蔥共檢測出61種揮發性化合物，其中含硫化合物27種、醛類13種、醇類13種、酮類4種，其他4種。白皮洋蔥中鑒定出37種揮發性成分，占流出組分總量的70.29%，主要成分有（E）-1-丙烯基-2-丙基二硫醚、二異丙基二硫醚、（E）-2,4-己二烯-1-醇、（E）-1-烯丙基-3-丙基三硫醚、壬醛、2,4-二甲基噻吩等；紅皮洋蔥中鑒定出40種揮發性成分，占流出組分總量的81.92%，主要有（E）-1-丙烯基-2-丙基二硫醚、二異丙基二硫醚、（E）-2,4-己二烯-1-醇、（E）-1-烯丙基-3-丙基三硫醚、甲基丙基二硫醚、（Z）-1-烯丙基-3-丙基三硫醚、二丙基三硫醚等；黃皮洋蔥鑒定出49種揮發性成分，占流出組分總量的79.03%，主要有（E）-1-丙烯基-2-丙基二硫醚、（E）-2,4-己二烯-1-醇、二異丙基二硫醚、（E）-1-烯丙基-3-丙基三硫醚、（Z）-1-烯丙基-3-丙基三硫醚、（Z）-1-甲基-2-丙烯基二硫醚、2,4-二甲基噻吩等。對三種色澤洋蔥各類揮發性成分進行對可以看出，黃皮洋蔥的含硫化合物的相對含量高于白皮和紅皮洋蔥，白皮洋蔥的醛類物質的種類和含量高于紅皮和黃皮洋蔥，紅皮洋蔥的醇類物質的種類和含量高于白皮和黃皮洋蔥。由上述可見，3種不同色澤洋蔥的揮發性物質種類和含量存在一定的差異。

由表1可以看出，三種色澤洋蔥揮發性成分相比較，三者的共有成分為22種，主要是12種含硫化合物、5種醛類和5種醇類。含硫化合物在三種色澤洋蔥的揮發性化合物構成中占比較大，特別是二異丙基二硫醚和（E）-1-丙烯基-2-丙烯基二硫醚，兩種物質相對含量的總和在三種色澤洋蔥的揮發性成分中占比率都超過了20%，對形成洋蔥特有特征風味貢獻較大，這與Rokayya等[23]的研究結果相似。三種色澤洋蔥共有的揮發性成分有22種，如（E）-烯丙基-1-丙烯基硫醚、甲基丙基二硫醚、2,4-二甲基噻吩、（Z）-1-甲基-2-丙烯基二硫醚、二異丙基二硫醚、1-烯丙基-2-異丙基二硫醚、丙醛、2-乙基-2-丁烯醛、（E）-2,4-己二烯-1-醇等組分，組成洋蔥的基本風味，但是不同品種洋蔥中共有成分的含量存在一定的差異，比如紅皮洋蔥中（E）-1-丙烯基-2-丙烯基二硫醚的含量（16.81%）高于白皮和黃皮洋蔥，而黃皮洋蔥中二異丙基二硫醚的含量（13.11%）較高。

表1 洋蔥揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds in onion

續表 1

揮發性成分的組成與含量的不同，構成了不同色澤洋蔥的特殊辛香味。含硫化合物是新鮮洋蔥中主要揮發性成分，同時也構成了洋蔥的特征風味。洋蔥中的含硫化合物主要來源于洋蔥的前體S-alk（en）ly-L半胱氨酸亞砜（ASCOs），當洋蔥被切碎時，該前體被蒜氨酸酶催化發生水解反應[24]。洋蔥中的含硫化合物包括單硫化物、二硫化物、三硫化物等物質，這些化合物能產生洋蔥所特有的原生的、濃郁的辛香味[25]。洋蔥中揮發性含硫化合物，如甲基丙基二硫醚、二甲基三硫醚等硫醚類化合物具有洋蔥、堅果香味，這類化合物大多能夠產生濃郁的辛辣味和擴散性氣息，因此硫醚類化合物是洋蔥特征風味的主要貢獻物質[26]。通過本實驗測定結果可以看出，白皮、紅皮和黃皮洋蔥中含硫化合物的相對含量分別為47.53%、64.01%和60.06%，紅皮和黃皮洋蔥的相對含量很接近，白皮洋蔥中含硫化合物相對含量遠低于其他兩種，因此紅皮和黃皮洋蔥的辛辣味和擴散性氣息比白皮洋蔥更強烈。

白皮、紅皮和黃皮洋蔥中檢測出的3,4-二甲基噻吩、2,4-二甲基噻吩和2,5-二甲基噻吩相對含量分別為0%、0.92%、0.62%，3.84%、3.57%、2.85%和0%、2.07%、1.65%，噻吩類物質是由硫代亞磺酸鹽降解產生的，同時也是三丙基二硫醚等物質的前體物質，具有尖刺的氣息和洋蔥濃郁的特征氣味[27]。紅皮和黃皮洋蔥中檢出的噻吩類物質相對含量高于白洋蔥，因此，紅洋蔥和洋蔥的辛辣、刺鼻的風味和氣味比白洋蔥更濃郁。白皮、紅皮和黃皮洋蔥中醇類揮發性成分的相對含量分別為11.70%、13.36%和13.60%，紅皮和黃皮洋蔥的含量很接近，且高于白皮洋蔥。三種洋蔥中檢測出的第三大類揮發性成分是醛類，白洋蔥、紅洋蔥和洋蔥中醛類揮發性成分的相對含量分別為9.54%、3.99%和4.12%，其中白皮洋蔥的醛類揮發性成分含量遠高于紅皮和黃皮洋蔥。由于不飽和化合物比飽和化合物的的香氣強，甚至產生刺激性的氣味，因此洋蔥的風味與其檢出的揮發性成分的碳鏈結構存在一定的關系。白皮、紅皮和黃皮洋蔥中不飽和鍵的醛類含量分別為2.93%、1.54%、1.21%，白皮洋蔥中不飽和鍵的醛類相對含量較高可能是構成其特殊辛香氣味的主要原因之一。2-甲基-2-戊烯醛是洋蔥催淚因子（硫代丙醛-S-氧化物）的主要代謝產物[12]，白皮、紅皮和黃皮洋蔥中的2-甲基-2-戊烯醛含量分別為0.58%、1.02%和0.44%，紅皮洋蔥中2-甲基-2-戊烯醛相對含量較高，因此這也是紅皮洋蔥比白皮和黃皮洋蔥容易導致人眼睛流眼淚的間接原因[28]。飽和醛類中三種洋蔥同時檢出且含量較高的是丙醛，白皮、紅皮和黃皮洋蔥中丙醛相對含量分別為1.72%、1.69%和1.65%，丙醛是構成生洋蔥香氣的最重要的化合物之一，也是切碎洋蔥后首先形成的揮發物之一[29]。洋蔥中檢出的第四大類揮發性成分是酮類，三種洋蔥中只有白皮和黃皮洋蔥中檢出了酮類，相對含量分別為1.4%和0.58%。酮類物質具有果香和青草樣的香氣，對洋蔥特征香氣的貢獻不大[26]。其他類中主要檢出的揮發性成分是2-氨基戊烷、正十一烷等一些烷烴類，這類物質由于風味閾值較高，使其對食品的整體風味貢獻不大，但是這類物質在協調和維持食品整體風味的過程中有著重要的作用[30]。

3 結 論

本文采用HS-SPME結合GC-MS分析三種不同色澤洋蔥的揮發性成分。首先對萃取纖維頭和頂空固相微萃取條件進行優化，以總離子流圖中的峰個數和總峰面積為考察指標，對影響萃取效果的萃取溫度、萃取時間和解析時間進行優化，得出較優的萃取條件為：50/30 μm DVB /CAR/PDMS萃取纖維頭，在加入5 mL飽和NaCl溶液的10 g洋蔥樣中，60 ℃溫度下萃取60 min，插入氣相色譜進樣口解析5 min，用來測定洋蔥中的揮發性成分。通過對三種色澤洋蔥的揮發性成分進行測定分析，共鑒定出61種揮發性成分，其中白皮、紅皮、黃皮洋蔥分別測到37、40、49種揮發性成分，相對含量分別占流出組分總量的70.29%、81.92%、79.03%。三種色澤洋蔥的共有揮發性成分有22種，含硫化合物在三種色澤洋蔥的揮發性化合物構成中占比較大，特別是二異丙基二硫醚和（E）-1-丙烯基-2-丙烯基二硫醚，兩種物質相對含量的總和在三種色澤洋蔥的揮發性成分中占比率都超過了20%，對形成洋蔥特有特征風味貢獻較大。揮發性成分的組成與含量的不同，構成了不同色澤洋蔥的特殊辛香味。含硫化合物是新鮮洋蔥中主要揮發性成分，同時也構成了洋蔥的特征風味，紅皮和黃皮洋蔥的含硫化合物的相對含量遠高于白皮洋蔥，因此紅皮和黃皮洋蔥的辛辣味和擴散性氣息比白皮洋蔥更強烈。2-甲基-2-戊烯醛是洋蔥催淚因子的主要帶謝產物，紅皮洋蔥中2-甲基-2-戊烯醛相對含量高于白皮和黃皮洋蔥，因此紅皮洋蔥比白皮和黃皮洋蔥容易導致人眼睛流眼淚。

通過分析表明，3種色澤洋蔥的揮發性成分的種類和組成存在著一定差異，特別是洋蔥含硫化合物種類和含量的差異導致了不同品種洋蔥的特征風味。但是特征香氣不僅與揮發性成分的含量和種類有關，更是與揮發性成分的閾值和各成分間相互作用相關聯，因此需要進一步采用氣相色譜-嗅聞技術確定洋蔥特征揮發性物質，為洋蔥精油生產提供理論依據，促進洋蔥產業高質量發展。