等離子體活化水作為解凍介質對牛肉殺菌效能及品質的影響

應可沁，李子言，程 序，錢 婧，章建浩，嚴文靜

（南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇省肉類加工與質量控制協同中心，江蘇南京 210095）

在食品工業高速發展的情況下，冷凍肉作為一種常見的加工食品原料，具有廣闊的市場空間。解凍主要是使肉類凍結過程中形成的冰晶融化被重新吸收，以恢復到原有新鮮狀態的過程[1]。在這個緩慢且不均勻的過程中，部分肉很可能會暴露在有利于微生物生長的溫度條件下，而解凍過程中，肉品內發生變化的許多物質則為微生物的生長提供了足夠的水分和養分；同時，肉品保水性等品質特性的變化不僅歸因于凍結時形成的冰晶對細胞的破壞作用，還與解凍過程中肌肉組織中蛋白氧化，構象、聚集特性的改變密切相關[2]。因此，冷凍肉制品的解凍過程不僅對其微生物安全性起重要作用，還會影響肉的關鍵品質屬性。當前常用的傳統解凍方法主要包括空氣解凍法和水解凍法，空氣解凍法生產成本雖低，但也有解凍速度較慢、汁液流失現象嚴重等缺點[2]；水解凍法速度雖快，但也存在可溶性物質流失、易被水中微生物所污染等問題。近年來，更多新型的肉類解凍方法也開始出現，包括微波、高壓、真空及超聲解凍等。與傳統方法相比，新型的解凍技術解凍速度較快、所需空間較小，具有一定優勢，但仍然存在著影響肉品品質、成本過高等不足，無法實現工業的普遍化應用。

然而，目前有關于解凍過程中微生物控制的研究較少，在食品的工業化應用中，亟需一種能夠確保微生物安全性并保持冷凍肉最大品質的解凍方法。低溫等離子體是指在高壓電源的作用下，不同氣體分子被部分或者完全電離分解成離子、電子、中性粒子、自由基、基態和激發態分子以及紫外光子等物質的集合，它被認為是第四態物質[3]。當水通過等離子體放電區域后便會形成等離子體活化水（plasmaactivated water，PAW）。空氣中的氧氣、氮氣和水蒸氣與等離子體發生反應，會生成多種短壽命的活性氧、活性氮等，這些氣態活性物質溶解到水溶液后，會使等離子體活化水中的硝酸根、亞硝酸根、過氧化氫以及過氧亞硝基等物質得到積累[4]，且過氧化氫等物質濃度隨著等離子體處理時間延長而而增加[5]。由于等離子體活化水具有高氧化還原電位（ORP）、低pH以及過氧化氫等活性氧氮物質積累等特點[6]，能破壞微生物的脂質、蛋白質、DNA等[7]，已被表明具有廣譜殺菌特性，但其研究主要集中于果蔬產品的浸泡殺菌，鮮應用于禽蛋制品或肉制品[8]。

因此，本文將等離子體活化水作為新型的解凍介質對冷凍牛肉進行處理，研究不同處理時間（40、60、80、100、120 s）制得的等離子體活化水對解凍牛肉及介質中的菌落總數、保水性、脂質氧化、亞硝酸根含量、pH、蛋白質流失狀況等理化指標的影響，以期用高效、簡單、安全、低成本的等離子體活化水解凍法同時實現肉品的解凍與殺菌[9]，在應對食品安全問題的同時，最大程度地保障牛肉的品質與風味，為其工業化應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛腱子肉 南京蘇果超市衛崗店；硫代巴比妥酸、甲醇、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、乙酸、氫氧化鉀、標準的結晶牛血清清蛋白、硫酸銅、酒石酸鉀鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂（PCA） 青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

PG-1000ZD低溫等離子體噴槍 南京蘇曼等離子科技有限公司；靜音無油空氣壓縮機 浙江藤井空壓機有限公司；CR-400型全自動色差儀 柯尼卡美能達控股公司；JA2203N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；BSC-250 型恒溫恒濕箱 上海博迅實業有限公司；DPH-9162電熱恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司；BagMixer400CC均質器 法國Interscience公司；UV-2600 紫外分光光度計 日本島津公司；數顯式pH測試儀 梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 等離子體活化水的制備 參照錢婧等[10]的方法制備等離子體活化水，采用射頻等離子裝置作為等離子體的發生器，以空氣作為工作氣體，裝置的孔口固定在液面下方約10 mm處，待處理去離子水量為300 mL，處理時間為40、60、80、100、120 s。將不同處理時間制得的等離子體活化水放置至常溫（25 ℃），作為解凍介質。在解凍開始前，取部分解凍介質進行亞硝酸根含量與pH的測定。

1.2.2 樣品的預處理 選取新鮮牛腱子肉，剔除筋膜后，順著肌纖維的方向切成（10±2）g的、形狀大小均勻、扁平方形的肉塊，分裝于密封袋，置于-20 ℃貯藏24 h后，用于后續實驗的測定。解凍時，將解凍介質與冷凍牛肉以4:1的質量比例進行浸泡解凍，以同樣為25 ℃的去離子水（DIW）浸泡解凍作為對照組進行浸泡解凍。在解凍介質中靜置浸泡10 min后，用潔凈的鑷子夾出樣品。依據測定指標的目的不同，有選擇性地測定解凍前、解凍后、介質及樣品中的指標。

1.2.3 對菌落總數的影響 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法進行檢測。解凍后牛肉中微生物的測定：將10 g牛肉置于無菌均質袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，用均質器以4次/s的檔位持續拍打2 min后，10倍梯度逐步稀釋均質袋中的混合液，進行涂布測定，結果以lg（CFU/g）表示。解凍介質中微生物的測定：吸取解凍液，10倍稀釋至合適梯度，進行涂布測定，結果以lg（CFU/mL）表示。

1.2.4 對保水性的影響 汁液損失率測定：測定牛肉在解凍前的質量并記錄，測定解凍后、用吸水紙吸除表面汁液后的牛肉質量并記錄。汁液損失率可用以下公式計算：

式中：A表示汁液損失率，%；m表示解凍前質量，g；m1表示解凍后質量，g。

持水力測定：將解凍后的牛肉剪成均勻的碎塊，在4 ℃下以15000 ×g的速度離心10 min，記錄并比較離心前質量與離心后的質量差別來衡量持水力的差別，從而反映等離子體活化水對其保水性的影響。持水力計算可用以下公式計算：

式中：WHC表示持水力，%；m1表示離心前質量，g；m2表示離心后質量，g。

1.2.5 對亞硝酸鹽殘留量的影響 參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的方法進行檢測，檢測解凍介質及牛肉的亞硝酸根含量。

1.2.6 對脂質氧化的的影響 根據GB 5009.181-2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》，參照黃明明等[11]的方法進行測定。

1.2.7 對pH的影響 參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》的方法進行檢測。稱取5 g 牛肉，加入45 mL去離子水，用高速均質機均質60 s，過濾后取上清液，將pH計室溫下校正后，進行測定濾液及解凍前后介質的pH。

1.2.8 對蛋白質含量的影響 參考李寧[12]的方法進行測定。用標準的結晶牛血清清蛋白（BSA）配制10 mg/mL的標準蛋白溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標準蛋白溶液，用水補足到1 mL，與4 mL的雙縮脲試劑反應30 min制得標準曲線。從不同處理組中各取1 mL解凍介質作為樣品測定，在540 nm處進行比色測定，將吸光度代入標準曲線方程，以計算解凍介質中蛋白質的含量，以判斷牛肉中蛋白質的流失狀況。所得標準曲線方程為以下公式：

式中：y表示吸光度；x表示蛋白質濃度，mg/mL。

1.3 數據處理

采用SPSS（版本25）軟件進行單因素方差分析（ANOVA），Duncan統計檢驗，差異水平P<0.05為顯著水平。數據以平均值±標準差（SD）表示，采用Origin2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 等離子活化水浸泡解凍對解凍牛肉及其介質的菌落總數群的影響

在傳統方法解凍的過程中，解凍時肉品會暴露在有利于微生物生長的環境溫度下，且由于肉制品含有豐富的蛋白質、脂肪等營養物質，擁有較高的水分活度，便為微生物的生長提供了充足的養分和水分[13]。因此，控制冷凍牛肉經解凍后的菌落總數對保障食品安全非常重要。由圖1a可知，經不同解凍介質解凍后，對照組牛肉中微生物的菌落總數為5.14 lg （CFU/g），當解凍介質為經過不同處理時間（40、60、80、100、120 s）所制得的等離子體活化水時，牛肉中的菌落總數分別降低至4.96、4.84、4.63、4.42、4.23 lg （CFU/g），各組處理間均具有顯著性差異，且隨著等離子體處理處理時間的延長，減菌效果顯著增強（P<0.05）。由圖1b可觀察到，解凍介質中的菌落總數也呈現相同變化規律，對照組解凍介質的菌落總數為3.19 lg（CFU/mL），而實驗組的分別為2.87、2.71、2.55、2.04、1.60 lg（CFU/mL），各組間均存在顯著性差異（P<0.05），從結果中得出，對微生物的減菌效果與等離子體活化水的處理時長有關，且隨著處理時長的增加，其對于解凍肉品的殺菌效果能夠顯著增強（P<0.05）。這種減菌效果是因為在低溫等離子體活化水具有高氧化還原電位、低pH等特點，且存在大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS），例如過氧化氫（H2O2）、單重態氧（1O2）、臭氧（O3）、一氧化氮（NO）和羥基（-OH），以及電子、離子等[14]，這些物質能夠破壞微生物的細胞壁、脂質與蛋白質等。此外，還會使微生物氧化應激，導致細胞膜滲漏與細胞死亡[5]。所以當其用作浸泡解凍的介質時，能夠發揮廣譜殺菌的效用。

圖1 解凍后牛肉及解凍介質中的菌落總數Fig.1 Total number of colonies in thawed beef and thawed media

2.2 等離子活化水浸泡解凍對解凍牛肉保水性的影響

保水性是肉類品質的重要指標，直接影響肉品的風味、營養價值、色澤、嫩度等。肉類在冷凍時會形成冰晶，而在解凍的過程中，這些能夠損傷肉品結構的冰晶融化，因為肉類往往無法完全吸收冰晶融化出來的水，便會造成汁液損失[1]；持水力則影響肉的外觀、熱加工過程中的熟肉得率及咀嚼時的多汁性等[15]。由圖2a、圖2b可知，將等離子體活化水作為解凍介質時，解凍牛肉的保水性不會發生顯著變化（P>0.05）。隨著其制備時間的增加，解凍牛肉的汁液損失率整體趨勢上先下降再上升，分別為1.11%、0.51%、0.44%、1.75%、3.23%；對照組汁液損失率為1.68%。處理組的持水力分別為94.55%、94.56%、97.36%、97.88%、94.75%，整體趨勢上先上升再下降，對照組的持水力為94.43%，這可歸因于當等離子體處理時間較短時，制得的等離子體活化水不會使解凍牛肉的蛋白質結構、肌肉纖維的完整性和空間結構遭到破壞[16]。甚至，處理時長在一定范圍內的等離子體活化水浸泡解凍能在一定程度上幫助維持其結構的穩定性，有利于保水性的提升。這是因為，保水性與肌原纖維蛋白的靜電荷數及蛋白質的網狀結構息息相關[17]，等離子體活化水中存在大量正負離子[18]，促使蛋白質的靜電荷效應增強與網絡結構形成，有利于水分的保持；但當等離子體活化水處理時長達到、以及超過80 s時，牛肉樣品的汁液流失率上升、持水力下降。這是因為，在相同的浸泡時間下，隨著處理時間的延長，等離子體活化水中的活性物質含量積累過高，會破壞樣品的組織結構，使肌纖維收縮、空隙增大[19]。此外，解凍過程中往往伴隨著蛋白質的氧化變性，這是導致汁液流失與保水性下降的重要原因[20]，而等離子體活化水浸泡則會促進蛋白質的氧化[4]，從而影響其保水性。已知優質肉品的汁液損失率應小于8.0%，持水力應高于76%[21]，本實驗樣品經等離子體活化水浸泡解凍后均在此范圍內，且與對照組相比未發生顯著變化，即解凍后牛肉屬于優質肉品，仍具有優良的食用品質。

圖2 解凍后牛肉汁液損失率及持水力變化Fig.2 Changes of juice leakage and water holding capacity of beef juice after thawing

2.3 等離子活化水浸泡解凍對解凍牛肉及其介質的亞硝酸根含量的影響

一方面，亞硝酸鹽的來源包括蔬菜、水果和加工肉類，肉制品中原本就存在一定的亞硝酸鹽[22]。另一方面，制備低溫等離子體活化水會產生大量活性氧與活性氮，例如一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）、三氧化二氮（N2O3）、四氧化二氮（N2O4）等，這些氮氧化物能夠參與亞硝酸根的形成[23]。而長期攝入過多的亞硝酸鹽會對人體健康造成損害，因此有必要對解凍樣品及介質中亞硝酸根的含量做檢測。由圖3a、圖3b可觀察到，對照組解凍牛肉的亞硝酸根含量為0.99 mg/kg，解凍介質的為0 μmol/L。經牛肉浸泡解凍后，解凍介質中的亞硝酸根含量與解凍前相比顯著降低（P<0.05）。經等離子體活化水浸泡解凍后的牛肉中亞硝酸根含量與對照組相比顯著增加（P<0.05），且隨著處理時長的增加，其中亞硝酸根的含量也越高，實驗組牛肉中亞硝酸根的含量分別為1.73、2.07、2.91、2.90、3.38 mg/kg。鮮肉制品中亞硝酸鹽的定量限（limit of quantitation，LOQ）為4.5 ppm[24]，而本實驗中，樣品經過不同處理時長的等離子體活化水浸泡解凍后，等離子體活化水處理時長為120 s的肉品亞硝酸根含量最高，為3.38 ppm，不超過允許的最大濃度，因此仍可以認為其是“天然的”，不對人體造成危害，符合食品安全，具有較好的品質。

圖3 解凍后牛肉及解凍介質中的亞硝酸根含量Fig.3 Nitrite contentin in thawed beef and thawed media

2.4 等離子活化水浸泡解凍對解凍后牛肉脂質氧化的影響

肉品脂質氧化的程度與其風味、色澤與營養價值息息相關。一般來說，人體感官能夠感知到的最低酸敗值為1.0 mg/kg[25]。在冷凍過程中，肉品中形成冰晶，破壞了肌細胞的結構，使肌纖維失去其完整性[26]，另外，解凍過程中血紅素鐵等氧化劑的釋放[27]也能使解凍后肉類脂質氧化的速度增大，對其貨架期造成負面影響。由圖4可知，解凍后對照組牛肉的丙二醛含量為0.0984 mg/kg，與之相比，經等離子體活化水浸泡解凍處理后，牛肉的脂質氧化程度顯著降低（P<0.05），分別為0.034、0.035、0.020、0.004、0.036 mg/kg，且均小于1.0 mg/kg，不會對產品的風味造成影響。由此可知，處理時長在一定范圍內的低溫等離子體活化水浸泡解凍可以顯著降低牛肉脂質氧化的程度，保護肉品的品質。這可能是因為，通過等離子體活化水浸泡解凍后，牛肉樣品中亞硝酸鹽的含量會升高，而亞硝酸鹽不僅能夠發色、抑制微生物生長，更能夠抑制脂質氧化[28]。此外，已知脂質氧化的機理包括三種途徑：自動氧化、酶促氧化、光氧化[29]，其中，動物體內的脂氧合酶會促使PUFA氧化，產生脂質氫過氧化物，加劇脂質氧化中酶促氧化途徑的程度[30]。而低溫等離子體活化水可以通過破壞酶的次級結構、特殊的化學鍵或側鏈的化學修飾等方式滅活內源酶[31]。因此，等離子體活化水抑制了脂氧合酶這一內源酶的活性，也可能是抑制脂質氧化程度的原因。然而，當等離子體活化水處理時長為120 s時，較之處理時長為100 s，肉品經浸泡解凍后的丙二醛含量顯著增加（P<0.05）。這是因為隨著處理時長的增加，等離子體活化水中活性氧及活性氮等活性氧化劑含量上升，從而在一定程度上加大脂質氧化的程度。但本實驗等離子體活化水處理時長為120 s時，其脂質氧化程度仍小于對照組，不造成負面影響。

圖4 解凍后牛肉脂質氧化程度Fig.4 Degree of lipid oxidation in thawed beef

2.5 等離子活化水浸泡解凍對解凍后牛肉及解凍牛肉前后介質pH的影響

pH是評價肉類品質的重要指標之一，直接影響肉制品的保水性、新鮮程度等[32]。由圖5a可知，解凍前，等離子體活化水的pH顯著小于對照組DIW的pH（P<0.05），為5.72。且隨著處理時長的增加，pH逐漸降低，分別為3.25、3.12、2.99、2.92、2.88。這是因為等離子體活化水中富含活性氧和氮類物質[33]，這些氮氧化合物與水反應則可以參與生成硝酸根和亞硝酸根[34]，提供酸化作用，從而使等離子體活化水具有低pH，更有利于其減菌作用。經過解凍后，對照組的pH較之解凍前顯著下降（P<0.05），為5.17，這可能是因為在解凍過程中，水中電解質流失，肉品中礦物和小分子蛋白質滲出流失，導致離子平衡的改變[35]，從而影響pH；而實驗組介質的pH則在解凍后顯著提高，分別為4.84、4.53、4.45、4.21、4.11，參照本實驗亞硝酸根含量的測定，這可能是因為介質中的亞硝酸根轉移至肉品中，使介質的pH有所回升；或是因為低溫等離子體活化水中的活性物質能夠抑制微生物分解蛋白質、含氮化合物等，使其堿性增加[36]；也可能是因為，導致等離子體活化水具有低pH特點的化學活性成分壽命短，硝酸、亞硝酸等易分解，因此低pH的現象只能持續較短時間，也不會產生健康風險[37]。已知肉制品解凍的過程中，最終pH上升0.2，則會導致明顯的促進肉腐敗[38]，而本實驗解凍后，經等離子體活化水浸泡解凍處理的介質pH較之對照組均顯著下降，且低pH可以抑制微生物的生長，可認為不會加劇肉的腐敗速度。由圖5b可知，對照組肉品的pH為5.81，實驗組肉品pH分別為5.82、5.86、5.86、5.87、5.86，這些差值很小，可能是因為誤差或樣品原料本身的差異所造成的，且均在正常范圍值內[39]，不會影響風味，具有較好的食用品質。

圖5 解凍后介質及牛肉中的pH變化Fig.5 Changes of pHbefore and after thawing media andthawed beef

2.6 等離子活化水浸泡解凍對解凍牛肉蛋白質流失狀況的影響

在解凍過程中，肉品中部分可溶性蛋白質會伴隨汁液損失而流失，從而降低肉品的營養價值。由圖6可知，對照組解凍介質中蛋白質含量為0.160 mg/mL，實驗組中蛋白質含量則分別為 0.111、0.098、0.092、0.075、0.146 mg/mL。除處理時長為120 s的處理組外，與對照組相比，低溫等離子體活化水浸泡解凍可以顯著降低解凍介質中蛋白質的含量，即顯著降低解凍過程中牛肉的蛋白質流失程度，且隨著處理時長的增加，其作用越顯著（P<0.05）。這可能是因為，在解凍過程中汁液損失的同時伴隨著礦物質和蛋白質的流失，而肉品系水力實質上受蛋白質分子靜電荷效應的影響[40]。等離子體活化水的電導率會隨著處理時間的增加而顯著升高，并產生大量正負離子[18]，這些離子的電荷增大了解凍牛肉肌原纖維間的靜電斥力，誘導肌原纖維的膨脹[20]，因而提升了其保水性[34]，維持了其肌纖維組織結構的完整性[41]，使可溶性蛋白質等內容物滲出減少，因此隨著處理時長的增大，其蛋白質流失狀況降低程度越顯著。但當處理時長達到120 s時，蛋白質流失率上升，這可能是因為經長時間處理后的等離子體活化水pH較低，打破了樣品內的電離平衡，且當制備等離子體活化水時處理時間過長時，導致其中活性成分過多，從而引起了蛋白質的分解、變性，甚至大分子空間網絡結構的破壞[42]，從而使導致此處理時蛋白質流失程度較高，但仍小于對照組，具有良好的營養價值。可認為以低溫等離子體活化水作為浸泡解凍的介質這一解凍方式，處理時長在一定范圍內時，對降低蛋白質流失率有顯著的積極作用，超過此范圍（本實驗為120 s）時，也不會造成負面影響，這一點與保水性的實驗結果在一定程度上具有相關性。

圖6 解凍后介質中蛋白質含量的變化Fig.6 Changes of protein content in the media after thawing

3 結論

本文將等離子體活化水作為新型的解凍介質用于冷凍牛肉的解凍。隨著PAW制備時間的延長，其減菌效果顯著增強，當等離子體處理時間為120 s時，冷凍牛肉經PAW處理后其菌落數可從5.14 lg （CFU/g）降至4.23 lg （CFU/g），可明顯降低浸泡解凍帶來的微生物污染風險。當PAW制備時間不超過100 s時，PAW可維持牛肉結構的穩定性，利于保水性的提升，并顯著降低解凍過程中牛肉蛋白質的流失。同時，PAW處理可明顯降低牛肉脂質氧化現象，且不會對牛肉的pH及亞硝酸根含量造成顯著影響。綜上可知，等離子活化水有望成為一種新型的解凍介質用于冷凍肉品的解凍，在高效解凍殺菌的同時不會對肉品品質造成明顯的影響。