姜黃素和/或有氧運動改善高脂血癥大鼠心肌細胞焦亡的作用機制

毛永強，周綺云，張馨月，楊洪志,

（1.首都體育學院研究生部，北京 100191；2.北京聯合大學，北京 100101）

脂代謝異常致高脂血癥是誘發心肌慢性炎癥反應、功能紊亂、結構受損的重要原因[1]。細胞焦亡作為細胞程序性、炎性死亡方式，廣泛存在于心血管疾病發生過程中，抑制細胞焦亡的發生與發展能夠有效抑制炎癥因子的生成和炎癥反應，降低組織損傷程度[2]。脂代謝異常誘發的炎性小體激活可以誘導焦亡發生，大量釋放炎癥因子，引發強烈炎癥反應，加速心血管疾病的發生與發展。適宜強度的有氧運動對于高血脂、炎癥等多種心血管危險因素均具有良好改善作用[3]。高脂飲食易誘發大鼠高脂血癥的同時，心肌NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）等焦亡相關蛋白及相關炎癥因子表達大幅升高，心肌組織形態發生改變，而有氧運動可以實現有效逆轉[1]。姜黃素是源自姜黃的多酚類化合物，具有改善細胞焦亡，抑制炎癥反應的潛在作用[4]。但二者單獨或聯合干預能否改善高脂血癥大鼠心肌細胞焦亡及炎癥反應，保護心臟功能/結構，尚未見報道。

本研究建立高脂飲食誘導高脂血癥大鼠模型，通過觀察脂代謝相關指標、心肌組織病理學診斷、心肌損傷標志物、心肌炎癥因子及細胞焦亡相關蛋白表達等多層次指標，探討姜黃素和/或有氧運動干預改善高脂血癥大鼠心肌細胞焦亡水平，保護心臟的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素（curcumin） 純度>95%，寧波中藥制藥股份有限公司（CP20191007）；羧甲基纖維素鈉 純度>99%，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）酶聯免疫試劑盒 北京華英生物技術研究所；NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase1）抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）抗體 美國Santa Cruz；5周齡SD大鼠（SPF級，雄性，180~200 g，生產許可證編號：SCXK（京）2016-0002）、基礎飼料及高脂飼料（60%脂肪熱量比飼料，生產許可證編號：SCXK京2019-0010） 斯貝福（北京）生物技術有限公司。

FA2004N電子天平 上海精密儀器有限公司；NR-B17CC型超低溫冰箱 日本松下電器產業株式會社；電子組織勻漿器 美國Kimble公司；LG 10-3A高速冷凍離心機 北京醫用離心機廠；DR-200BS酶標分析儀 無錫華衛德朗；AU480生化分析儀 美國Beckman；LEICA RM2016病理切片機德國RM公司；Pannoramic MIDI全自動數字切片掃描系統 匈牙利3D HISTECH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 經7 d適應性飼養及訓練后，將符合實驗要求的50只雄性SD大鼠按體重分為5組（隨機數字法），每組10只：普通膳食+安靜組（RDC組）、高脂膳食+安靜組（HDC組）、高脂膳食+姜黃素+安靜組（HDCC組）、高脂膳食+有氧運動組（HDM組）和高脂膳食+姜黃素+有氧運動組（HDCM）。實驗過程中，室內溫度控制在20~24 ℃，相對濕度控制在55%~75%，晝夜明暗交替時間：12/12 h。各組大鼠每天自由攝食飲水；RDC組以普通飼料喂養，其他各組以高脂飼料喂養。第3周起，HDCC和HDCM組根據文獻[5]及預實驗確定最佳劑量為400 g/（kg·d）、體積為5 mL/kg，每次訓練前0.5 h灌胃姜黃素溶液（0.5%羥甲基纖維素鈉配成混懸液），每天1次，其余各組均以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；HDM和HDCM組進行有氧運動干預[6]，坡度：5°，速度：70%~75%最大攝氧量，運動時長：1 h，頻率：1次/d，6 d/w，其他組無任何運動干預。干預持續時間：6 w。

1.2.2 實驗動物取材 末次訓練結束后24 h，烏拉坦適度麻醉大鼠后腹主動脈取血，室溫自然凝固，待血清出現后4 ℃離心10 min，3000 r/min，分離血清，?20 ℃凍存待測。開腹后，迅速取出心臟，去除非心臟組織后以預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分后，取部分左心室心肌組織剪成小塊后稱取重量，根據組織重量:體積=1:9的比例置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，隨后充分研磨制成10%的心肌組織勻漿液，5000 r/min離心5 min取上層清液待測。另取部分左心室心肌組織浸入4%多聚甲醛固定液固定，用于心肌組織病理診斷。

1.2.3 血脂水平、心肌損傷標志物及心肌細胞炎癥因子含量的測定 血清甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、肌酸肌酶同工酶MB型（creatine kinase-MB，CK-MB）采用全自動生化分析儀測定。心肌IL-1β、IL-18采用酶聯免疫法用試劑盒進行測定。

1.2.4 心肌組織病理診斷 取經多聚甲醛固定心肌組織，經脫水、透明、包埋、切片后HE染色進行病理診斷。

1.2.5 免疫組化法檢測心肌組織相關蛋白質表達水平 免疫組化法檢測心肌NLRP3、ASC、caspase-1蛋白質表達水平。石蠟切片經脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、一抗和二抗孵育、DAB顯色、復染細胞核、封片。數字掃描儀進行斷面全景掃描，計算組織化學評分[7]：細胞核陽性由強至弱依次為深棕、棕黃、淺黃，藍色為陰性。H-score=（淺黃色細胞密度×1）+（棕黃色細胞密度×2）+（深棕色細胞密度×3）。

1.3 數據處理

根據2×2析因設計的方差分析，將HDC組、HDCC組、HDM組及HDCM組大鼠血清和心肌相關生化指標等數據納入分析。

2 結果與分析

2.1 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠血脂水平的影響

長期高脂飲食會破壞脂質代謝，誘發高脂血癥，主要表現為血脂水平異常。Zhao等[8]表明，有氧運動能夠有效改善血脂代謝，防控高脂血癥的發生與發展。姜黃素具有良好的抗氧化和降血脂特性。Saker等[9]研究發現，姜黃素可以有效改善長期黃油飲食小鼠脂代謝紊亂及對器官結構的有害影響。科學運動和合理營養是健康的兩大支柱，二者的聯合干預能夠有效改善高脂血癥，保護相關器官功能和結構。張亞莉等[10]研究發現中等強度運動和大蒜素均可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，且兩者具有協同效應，聯合干預效果最佳。劉靜等[11]研究發現有氧運動聯合丹皮酚干預能夠明顯改善由高脂飲食誘導的肥胖伴脂質代謝紊亂，能夠降低肝臟指數，有效調節脂質代謝緩解脂肪蓄積，效果優于單獨干預。

在本研究中，為期8周實驗結束后，與RDC組相比，HDC組血清TC、TG、LDL-C均極顯著升高（P<0.01）；與HDC組相比，HDCC、HDM、HDCM組血清TC、TG均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組血清TC較HDCC、HDM顯著降低（P<0.05或P<0.01）；HDCM組與HDCC組、HDM組間血清TG無顯著性差異（P>0.05）。對于血清LDL-C水平，與HDC組相比，HDCC組、HDCM組顯著降低（P<0.05或P<0.01），HDM組與HDC組間無顯著性差異（P>0.05）；HDCM組較HDCC組、HDM組均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。對于血清HDL-C水平，HDC組較RDC組顯著降低（P<0.05）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；HDCM組較HDM組極顯著升高（P<0.01），與HDCC組無顯著性差異（P>0.05，表1）。基于相關文獻及以上結果說明，8周高脂飲食誘發大鼠高脂血癥，血脂水平異常；姜黃素和/或有氧運動干預可以有效改善大鼠血脂水平，其中聯合干預效果最佳，與相關研究較為一致。

表1 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on blood lipid of high-fat diet rats

2.2 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌損傷標志物及心肌細胞炎癥因子含量的影響

脂代謝紊亂是誘發心肌慢性炎癥反應的重要原因之一。有氧運動具有良好的抑炎作用，可以有效地抑制炎癥誘發的心肌損傷，保護心臟。Chen等[1]研究發現有氧運動降低高脂飲食大鼠血脂水平的同時可以通過減少炎癥、纖維化和凋亡來逆轉心臟重構。Yang等[12]研究發現早期中等強度有氧運動可以下調阿霉素引發的炎癥反應，降低CK-MB水平，改善心肌形態及功能。姜黃素亦可通過抑制炎癥反應，保護心臟。Zeng等[13]研究發現8周50 mg/kg姜黃素干預可以有效降低高脂飲食小鼠心肌炎癥及細胞凋亡水平，改善心肌形態。Liu等[14]研究發現姜黃素具有抗冠狀動脈微栓塞心肌損傷的作用，其作用機制與抑制心肌炎癥反應有關。何柳[15]研究發現姜黃素聯合有氧運動較二者單獨干預能夠更為有效地降低血液及心肌炎癥因子水平，延緩炎性衰老，保護心臟。

本研究中，為期8周實驗結束后，對于心肌IL-1β、IL-18含量，HDC組較RDC組均極顯著升高（P<0.01）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組較HDCC、HDM組顯著降低（P<0.05或P<0.01）。對于心肌損傷標志物CK-MB，HDC組較RDC組均極顯著升高（P<0.01）；HDCC、HDM、HDCM組較HDC組均極顯著降低（P<0.01）；HDCM組較HDCC、HDM顯著降低（P<0.01，表2）。以上結果說明，8周高脂飲食誘發大鼠高脂血癥的同時，引發心肌炎癥反應及損傷；姜黃素和/或有氧運動干預可以有效改善炎癥反應及損傷程度，其中聯合干預效果最佳，與相關研究較為一致。

表2 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌損傷標志物及心肌細胞炎癥因子含量的影響Table 2 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on myocardial injury markers and inflammatory factors of high-fat diet rats

2.3 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌組織形態的影響

各組大鼠心肌組織病理學觀察顯示（圖1），RDC組大鼠心肌纖維結構清晰，染色均勻，細胞質呈紅色，細胞核呈藍黑色，細胞排列規律，境界清楚。HDC組大鼠心肌纖維排列紊亂，細胞肥大，著色不均，可見明顯淋巴細胞聚集，提示有慢性炎癥變化。HDCC、HDM、HDCM組大鼠心肌纖維排列較整齊，細胞形態較完整，偶見心肌纖維腫脹和輕度淋巴細胞聚集，較高脂飲食組明顯改善，其中聯合干預組改善情況最顯著。以上結果表明，8周高脂飲食誘發大鼠心肌炎性損傷；姜黃素和/或有氧運動干預可以有效改善損傷程度，其中聯合干預效果最佳。

圖1 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌組織形態的影響（HE，400×）Fig.1 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on myocardial microstructure of high-fat diet rats （HE, 400×）

2.4 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌焦亡相關蛋白表達的影響

細胞焦亡在心血管疾病的發生、發展中具有重要作用[2]，其以細胞溶解和大量炎性細胞因子釋放為特征。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和Caspase-1等組成。NLRP3炎癥小體激活可生成具有活性的Caspase-1，而Caspase-1不僅能促進IL-1β的成熟和釋放，還可以直接誘導細胞焦亡[16]。NLRP3的激活與飲食和運動有著明顯的交互作用。Yu等[17]研究發現姜黃素可以有效抑制阿霉素誘發的心肌細胞焦亡，保護心臟功能/結構損傷。Yin等[4]研究發現姜黃素可以通過下調NLRP3、Caspase-1表達，抑制細胞焦亡，改善新生大鼠壞死性微小結腸炎。趙金理[18]研究發現姜黃素可以姜黃素干預可以顯著抑制氧化三甲胺誘發動脈粥樣硬化中焦亡相關分子Caspase-1、NLRP3、IL-1β的過度表達，且具有濃度效用。卞學鵬等[19]研究發現12周有氧運動可以顯著降低胰島素抵抗小鼠海馬細胞焦亡相關蛋白及炎癥因子表達。Chen等[1]研究亦發現，有氧運動可以改善高脂血癥大鼠心肌焦亡及炎癥反應。

本研究中，為期8周實驗結束后，心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達（H-score），HDC組極顯著高于RDC組（P<0.01），HDCC組、HDM組、HDCM組顯著低于HDC組（P<0.05或P<0.01），其中NLRP3、ASC、Caspase-1，HDCM組顯著低于HDCC組、HDM組（P<0.05或P<0.01，表3，圖2）。以上結果表明，細胞焦亡參與了高脂血癥大鼠心肌損傷過程；姜黃素可能通過阻斷NLRP3的組裝和活化，抑制焦亡相關分子ASC、Caspase-1、IL-1β的過度表達[4,17?18]；有氧運動可能通過改善高脂飲食誘發的炎癥反應，降低NLRP3炎癥小體自身及其上下游相關分子改善焦亡[1,19?20]。聯合干預效果最佳。

圖2 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂大鼠心肌焦亡相關蛋白表達的影響（IHC，400×）Fig.2 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on expression of myocardial pyroptosis related proteins of high-fat diet rats（IHC，400×）

表3 姜黃素和/或有氧運動干預對高脂飲食大鼠心肌焦亡相關蛋白表達的影響（H-score）Table 3 Effect of curcumin and/or aerobic exercise intervention on expression of myocardial pyroptosis related proteins of high-fat diet rats (H-score)

3 結論

本研究中，8周高脂飲食誘發大鼠高脂血癥的同時，心肌細胞焦亡及炎癥反應加劇，心肌組織出現炎性損傷并出現結構異常。姜黃素和/或有氧運動干預均可以抑制焦亡相關因子的過度表達，發揮保護作用，其中以聯合干預效果最佳。