基于網(wǎng)絡藥理學的芡實-金櫻子藥對治療糖尿病腎病的分子機制研究

李瀟然 王雪瑩 張 華 王世東 鄭曉艷

1.東直門醫(yī)院腎病內分泌科二區(qū)，北京 100700；2.北京電力醫(yī)院老年病科，北京 100073

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病的主要原因。近年來，DN 患病率逐年提高，我國成人2 型糖尿病患病率為10.4%，其中20%～40%的2 型糖尿病患者合并DN[1]。目前，尿蛋白被認為是DN 進展以及導致不良腎臟結局的關鍵危險因素，與腎小球濾過率的降低及死亡風險的增加密切相關[2]。

DN 中醫(yī)屬消渴病腎病范疇，為消渴病日久，耗氣傷陰，五臟受損，兼夾痰熱郁瘀而致病[3]，國醫(yī)大師呂仁和教授認為消渴病進入消癉期，痰熱郁瘀積聚于腎之絡脈，形成“微型癥瘕”，久而腎體受損，腎元不固，尿中蛋白流失，形成蛋白尿[4]。故臨床在重視活血消癥治法的基礎上，配伍芡實、金櫻子以固腎澀精，減少蛋白尿[5]。本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法探討芡實-金櫻子藥對在降低DN 尿蛋白方面的靶點，為深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及藥物-疾病靶點篩選

應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫（encyclopaedia of traditional Chinese medicine，ETCM）檢索藥物活性成分，設定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18，通過PubChem 網(wǎng)站獲得活性成分結構，利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫獲得藥物靶點，將所得靶點錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫完成靶點篩選。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫及OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetic nephropathy”得到DN 疾病靶點。

1.2 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡構建

將藥物靶點及DN 相關靶點取交集獲得藥物-疾病交集靶點，并將藥物、藥物成分及藥物-疾病交集靶點關系網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.8.0 軟件進行可視化分析，形成藥物靶點關系網(wǎng)絡圖。

1.3 交集靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及拓撲分析

將交集靶點通過STRING 11.0 平臺構建PPI 網(wǎng)絡，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“highest confidence”。通過Cytoscape 軟件中NetworkAnalyzer 插件進行PPI 拓撲結構分析，并篩選前20 的核心靶點。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

應用RGUI 3.61 軟件及Bioconductor-clusterProfiler 3.14 工具對交集基因進行GO 富集分析，包括分子功能、生物學過程及細胞組分的富集，利用Bioconductor-pathview 1.26 工具獲取KEGG 通路，限定pvalue＜0.01，qvalue＜0.05，提取前5 條GO 富集結果，生成柱狀圖，提取前20 條KEGG 通路生成點圖，完成主要KEGG 通路圖后，將交集基因標記在通路上。

1.5 核心成分、靶點的分子對接

檢索蛋白質數(shù)據(jù)庫、有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫獲取核心成分、靶點3D 結構，應用Mgltools 軟件確定活性口袋范圍，通過VINA 軟件完成分子對接，通過Pymol 軟件獲得對接模式圖，并計算最小結合能。

2 結果

2.1 藥物活性成分

通過對TCMSP、ETCM 檢索及篩選，得到芡實活性成分2 個，金櫻子活性成分7 個。見表1。

表1 芡實-金櫻子活性成分

2.2 藥物-疾病靶點

檢索篩選后共得到藥物靶點353 個，DN 靶點2746 個。共獲得藥物與疾病交集靶點196 個，其中金櫻子單獨關聯(lián)DN 靶點162 個，芡實單獨關聯(lián)7 個，藥對共同關聯(lián)靶點27 個。

2.3 靶點關系網(wǎng)絡構建

構建芡實-金櫻子藥對靶點關系網(wǎng)絡圖，見圖1。圖中196 個藥物疾病交集靶點以矩形標記，9 個藥物活性成分以六邊形標記，兩者連線共438 條。藥物活性成分方面，槲皮素、山柰酚、廿碳-11-烯酸具有較多DN 相關作用靶點。靶點方面，前列腺素內過氧化物合酶2、前列腺素內過氧化物合酶1、雄激素受體等靶點具有較高的活性成分關聯(lián)度。

圖1 芡實-金櫻子藥對靶點關系網(wǎng)絡圖

2.4 靶點PPI 網(wǎng)絡

構建交集靶點的PPI 網(wǎng)絡模型，通過拓撲結構分析，篩選前20 的核心靶點，構建核心靶點蛋白網(wǎng)絡圖，得到主要核心靶點：絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）1、轉錄因子AP1（Jun）、MAPK3 等。見圖2。

圖2 藥物-疾病交集靶點的PPI 網(wǎng)絡及核心靶點蛋白網(wǎng)絡

2.5 核心靶點的GO 及KEGG 通路富集分析

GO 富集分析結果顯示，芡實-金櫻子藥對作用靶點主要分子功能為核受體活性、轉錄因子活性以及類固醇激素受體活性，主要參與對抗生素應答、對脂多糖應答以及對氧化應激反應應答等生物學過程，主要存在于膜筏、膜微區(qū)以及膜區(qū)域等細胞組分，見圖3。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 通路為核心通路，見圖4，導出該通路圖并將藥對作用靶點標記為灰色，見圖5。

圖3 藥對-疾病相關靶點GO 富集分析結果

圖5 AGE-RAGE 通路圖

2.6 核心成分靶點分子對接

選取AGE-RAGE 通路多條核心通路為切入點，分別選取MAPK 通路核心靶點MAPK1 與主要成分槲皮素進行分子對接（結合能為-8.0 kcal/mol），PI3K-Akt 通路核心靶點Akt1 與成分山柰酚分子對接（結合能為-8.1 kcal/mol），下游核心炎癥因子轉錄因子AP1（Jun）與山柰酚分子對接（結合能為-9.2 kcal/mol），NF-κB 家族蛋白RELA 靶點與槲皮素分子對接（結合能為-7.4 kcal/mol），構建分子對接模式圖。見圖6。

圖6 核心成分靶點分子對接模式圖

3 討論

DN 屬中醫(yī)消渴病腎病范疇，是由于脾虛無力統(tǒng)攝精微、腎虛封藏失職，痰熱郁瘀積聚于腎之絡脈，導致精氣下瀉，即出現(xiàn)蛋白尿[6]。現(xiàn)代醫(yī)學認為DN 的發(fā)病機制與晚期糖基化終末產(chǎn)物生成增多[7]、蛋白激酶C激活、多元醇活躍及氧化應激增強等多種糖脂代謝密切相關[8]，可導致腎小球毛細血管內皮細胞、足細胞凋亡、系膜細胞外基質堆積及腎小球基底膜增厚，從而出現(xiàn)尿蛋白增多及腎功能惡化[9]。

芡實-金櫻子藥對出自水陸二仙丹，芡實可益腎固精，金櫻子可固精縮尿，兩者相須為用，具有平補脾腎、收斂固攝之效[10]。金櫻子的核心成分槲皮素、山柰酚，在DN 的治療中發(fā)揮著主要作用。槲皮素可以抑制凋亡蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、白細胞介素-1β 的表達，起到抗凋亡作用[11]，抑制足細胞分泌血管內皮生長因子[12]，起到腎臟保護作用。山柰酚可抑制DN 大鼠腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子的表達，對DN 大鼠腎功能起保護作用[13]。除此之外，金櫻子多種成分均關聯(lián)了靶點AR、孕酮受體，發(fā)揮著類固醇激素受體功能。而有研究證實，調節(jié)機體性激素水平，可一定程度上改善腎臟損傷[14]。而芡實主要活性成分如β-胡蘿卜素及維生素E，具有一定的抗氧化作用[15]，在兩藥配伍中發(fā)揮著協(xié)同增效的抗氧化作用。

通過GO 富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)芡實、金櫻子靶點主要位于細胞膜區(qū)，發(fā)揮著細胞信號轉導及核轉錄在內的多種生物功能，完成對脂多糖、氧化應激的多重調控作用。通過對關鍵靶點的KEGG 通路富集分析及分子對接驗證，本研究發(fā)現(xiàn)芡實、金櫻子主要作用于AGE-RAGE 信號通路，及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多個信號通路，發(fā)揮抗氧化應激、抑制炎癥反應、抗纖維化等多重腎臟保護功能。

AGE-RAGE 通路，可致活性氧的產(chǎn)生增加，加重腎小球系膜細胞損傷及足細胞凋亡[16]。MAPK 通路是細胞生長及炎癥反應應答的重要通路，可激活下游復雜炎癥反應通過轉錄因子AP1（Jun）、NF-κB，起到增加活性氧、激活RAS 系統(tǒng)、調節(jié)炎癥因子釋放等多種病理作用[17]，是DN 發(fā)展惡化的重要反應通路[18]。PI3k-Akt 通路是AGE-RAGE 下游重點通路之一，是保腎藥物抑制細胞凋亡的關鍵通路[19]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3k在DN 模型大鼠組織中高表達[20]，同時尿蛋白定量的降低與PI3K-Akt 通路中的PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達作用相關[21]，可見該通路發(fā)揮了延緩DN 患者腎臟損傷的作用。

作為MAPK、PI3k-Akt 通路下游共有的核心通路，NF-κB 信號通路在DN 發(fā)展過程中，參與免疫、炎癥及細胞凋亡多種重要生物學過程[22]，而MCP-1 蛋白在通路中起重要的介導作用[23]。有研究指出，DN 病程中機體內炎癥因子NF-κB、MCP-1 水平與尿蛋白的水平呈正相關[24]，在DN 炎癥反應過程中發(fā)揮著重要作用[25]。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，初步分析了芡實-金櫻子藥對治療DN 的可能機制。結果發(fā)現(xiàn)，芡實-金櫻子藥對的調控作用主要涉及AGE-RAGE信號通路及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多個信號通路，涵蓋了多途徑、多靶點調控復雜炎癥反應及氧化應激過程，為進一步實驗及臨床藥理研究提供線索和依據(jù)。