HGF過表達對慢阻肺小鼠肺功能、肺動脈壓力的影響及其作用機制

吉圣珺 李敏菁 溫業良 賴其廷 張培芳

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease)簡稱慢阻肺，是一種慢性呼吸系統疾病，病情呈進行性發展會引發肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)，形成慢性肺源性心臟病，無法徹底治愈[1-2]，臨床只能采取對癥藥物治療緩解慢阻肺患者癥狀，而藥物長期使用產生的費用和副作用給患者、家庭及社會均帶來了沉重的負擔[3-5]。因此，尋找慢阻肺的有效治療方法極為重要。肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)是一種間充質來源的多肽生長因子，具有促進內皮損傷修復、抑制細胞凋亡等多重功效[6-7]。有研究報道，HGF在氣道損傷修復、肺泡再生等方面起著積極作用[8]。同時HGF還可逆轉肺氣腫的生理和形態學變化[9]。但HGF在慢阻肺中的作用機制尚不清楚。本研究旨在觀察HGF對慢阻肺小鼠肺功能及肺動脈壓力的影響，并探討其作用機制。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物 野生型C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～22 g，我院醫學部實驗動物中心提供，飼養環境：室溫22～26℃，相對濕度45～65%，標準飼料喂養，自由進食、飲水。

2 主要試劑和儀器 主要試劑：不攜帶HGF基因的腺病毒載體和攜帶HGF基因的腺病毒載體均由中國醫學科學院提供；戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術有限公司)；萬寶路牌香煙(湖南中煙工業有限責任公司)；PI3K抑制劑LY294002(美國Sigma公司)；RIPA細胞裂解液(普利萊基因技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；TRIzol試劑盒(美國Life technologies公司)，cDNA反轉錄試劑盒(美國Sigma公司)；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2×)(美國ThermoFisher公司)；鼠源HGF、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin抗體(英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體(上海榮盛生物技術有限公司)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(10×)(上海芳甸生物科技有限公司)，TUNEL試劑盒(美國Promega公司)，Apelin檢測試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)。

主要儀器：多參數肺功能檢測系統(上海玉研科學儀器有限公司)，動物多導生理記錄儀(上海玉研科學儀器有限公司)，UV-1900型紫外分光光度計(讓奇(上海)儀器科技有限公司)，實時熒光定量 PCR 儀(美國ThermoFisher)，All-in-One 熒光顯微成像系統 BZ-X(基恩士 (中國) 有限公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，蛋白電泳儀及轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

二、實驗方法

1 慢阻肺模型的建立及分組 40只C57BL/6J小鼠適應性喂養一周后，以隨機數字表法分為對照組、模型組、HGF組、HGF+LY294002組，每組10只。除對照組小鼠給予等量生理鹽水外，模型組、HGF組、HGF+LY294002組3組小鼠均參照文獻[10]以香煙塵霧顆粒(Cigarette dust particles，DSP)經鼻腔滴入法建立慢阻肺小鼠模型。具體過程為：⑴制備DSP溶液：取除去濾嘴的3支萬寶路牌香煙(焦油量：12 mg，煙氣煙堿量：0.9 mg，煙氣一氧化碳量：12 mg，煙長：84 mm)，用裝有1 mL蒸餾水的水煙斗(連接真空吸塵器)收集煙霧，水煙斗接口處用無菌棉花濾過，獲得DSP溶液，無菌條件下吸取上述方法制備的 DSP 3 μL于2 mL 離心管中，加1 mL無菌生理鹽水，混勻，配制成 3 mL/L DSP溶液。⑵DSP誘導慢阻肺模型：各組小鼠分別采用乙醚短暫麻醉，每天分別滴鼻3 mL/L DSP溶液，每只20 μL，連續滴鼻30 d。造模后觀察到小鼠活動減少，呼吸急促，伴喘息、咳嗽，嚴重者聽診可聞及濕啰音，反應靈敏度變差，進食下降，體重逐漸減輕，肺組織HE染色病理切片顯示肺部支氣管壁增厚，管腔嚴重變形，肺部可見大量炎細胞浸潤，肺泡結構紊亂，肺泡壁破裂，肺泡腔擴大，部分融合形成較大的囊腔，即為造模成功。

2 動物處理 模型建立成功后第2天，模型組小鼠氣管內滴入不攜帶HGF基因的腺病毒2×109pfu/只，HGF 組小鼠氣管內滴入攜帶 HGF 基因的腺病毒2×109pfu/只，HGF+LY294002組小鼠氣管內滴入攜帶 HGF 基因腺病毒2×109pfu/只，同時尾靜脈注射LY294002(2.0mg/kg)，對照組小鼠氣管內滴入同等劑量的等張力生理鹽水。在相同條件下單籠飼養4周，肺功能指標及肺動脈壓力指標檢測結束后處死小鼠留取肺組織，一部分-80℃保存，一部分用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，備用。

3 肺功能及肺動脈壓力檢測 各組小鼠給予戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，將小鼠以仰臥位固定于手術臺上，常規消毒頸部皮膚，剪開頸部皮膚，分離血管和肌肉，暴露主支氣管，用鑷子將縫合線置于氣管底部，局部按壓進行止血，以剪刀切開主氣管小口，避免血液進入氣管，置入氣管插管，以縫合線固定后，連接多參數肺功能檢測系統檢測各組小鼠的潮氣量(Tidal volume，TV)、呼氣峰流速(Peak expiratory flow，PEF)、吸氣峰流速(Peak inspiratory flow，PIF)、0.3秒用力呼氣量(0.3 sec forced expiratory volume，FEV0.3)，0.3秒用力呼氣量與用力肺活量比(0.3 sec forced expiratory volume to forced vital capacity ratio，FEV0.3/FVC)。同時將充入2%肝素鈉的聚乙烯導管經小鼠右側頸部靜脈插管右心至肺動脈干，連接壓力換能器，穩定10 min后，采用動物多導生理記錄儀記錄各組小鼠平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)。

4 ELISA測定肺組織Apelin水平 取各組小鼠肺組織勻漿標本，4 ℃低溫下10000 r/min離心5 min，收集上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明操作檢測Apelin水平，在紫外分光光度計上于450 nm處檢測吸光(OD)值，根據樣品OD值在標準曲線圖上查出相應Apelin含量，乘以稀釋倍數即可。

5 RT-PCR檢測肺組織HGF mRNA表達 取各組小鼠肺組織樣品0.02 g，加入Trizol試劑1 mL，液氮條件下將肺組織充分研磨，室溫靜置5 min提取RNA，應用紫外分光光度計測量RNA濃度，A260/280在1.8～2.1范圍內即可。根據反轉錄試劑盒合成cDNA，進行RT-PCR反應檢測HGF mRNA水平，RT-PCR反應體系為：Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL，10 μmol/L的上游引物和下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，加雙蒸水(Water distillated two times，ddH2O)補充至20 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行40個循環，實驗重復3次。HGF上游引物：5′-AGCTCAGAACCGACCGGCTTGCAACAGGAT-3′；下游引物：5′-TTACCAATGATGCAAT-TTCTAATATAGTCT-3′；內參β-actin上游引物：5′-TCTTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′；下游引物：5′-CG-TTTCTGCGCCGTTAGGT-3′；采用2-△△Ct計算分析目的基因的相對表達水平。

6 Western blot檢測肺組織HGF、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表達 取各組小鼠肺組織樣品0.02 g，充分研磨后，用RIPA細胞裂解液冰上裂解10 min提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度。取適量裂解產物，上樣后進行SDS-PAGE分離蛋白，電轉至硝酸纖維素膜，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)洗3次，加入5 %脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h，PBST洗滌后加入HGF抗體(1 ∶500)、Caspase-3抗體(1 ∶500)、Bcl-2抗體(1 ∶500)、PI3K抗體(1 ∶500)、p-PI3K抗體(1 ∶500)、Akt抗體(1 ∶500)、p-Akt抗體(1 ∶500)和β-actin抗體(1 ∶5000)孵育，4 ℃過夜，用PBS洗膜3次，每次10 min，加入相應HRP標記的二抗(1 ∶1000)，室溫孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，采用ECL化學發光液進行顯影，圖像分析系統分析統計目的蛋白相對表達量，實驗重復3次。

7 TUNEL法檢測細胞凋亡情況 取各組小鼠肺組織標本石蠟切片脫蠟水化，PBS徹底沖洗，滴加稀釋后的蛋白酶 K 工作液，37 ℃反應30 min，平衡緩沖液孵育20 min，PBS洗滌3次，擦干切片周圍緩沖液，加入50 μL TUNEL反應混合液，37℃避光反應 60 min，置于DAPI染色液中孵育30 min，前后PBS 沖洗 3 次，加50 μL DAB底物(×20)，室溫下反應10 min，蘇木精復染3 min，然后脫水、透明、中性樹膠封片，采用熒光顯微鏡觀察采集圖像，倍數為40*10倍。正常細胞核呈藍色，細胞核呈綠色的細胞即為陽性細胞。每張切片隨機選取 5 個視野拍照，計算細胞凋亡指數(AI)，AI =凋亡細胞數/細胞總數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、各組小鼠肺功能及肺動脈壓力比較

與對照組比較，模型組小鼠肺功能指標TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著降低(P<0.05)，mPAP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，HGF組小鼠肺功能指標TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著升高(P<0.05)，mPAP水平顯著降低(P<0.05)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺功能指標TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC水平均顯著降低(P<0.05)，mPAP水平顯著升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠肺功能及肺動脈壓力比較

二、各組小鼠肺組織Apelin水平比較

各組小鼠肺組織Apelin水平均有顯著性差異(F=18.461，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠肺組織Apelin水平顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織Apelin水平顯著升高(P<0.05)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織Apelin水平顯著降低(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織Apelin水平比較

三、各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平比較

各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平均有顯著性差異(F=16.735，P<0.001；F=15.081，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.001；P<0.001)，HGF組和HGF+LY294002組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，HGF組和HGF+LY294002組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)(見圖2A、B)。

圖2 各組小鼠肺組織HGF mRNA和蛋白表達水平比較

四、各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較

各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平均有顯著性差異(F=21.468，P<0.001；F=20.726，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)。與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)(見圖3A、3B)。

圖3 各組小鼠肺組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較

五、各組小鼠肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平比較

各組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均有顯著性差異(F=19.400，P<0.001；F=17.800，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.001；P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著升高(P<0.001；P<0.001)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.001；P<0.001)(見圖4A、4B、4C)。

圖4 各組小鼠肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平比較

六、各組小鼠肺組織細胞凋亡情況比較

各組小鼠肺組織AI均有顯著性差異(F=31.667，P<0.001)。與對照組比較，模型組小鼠肺組織AI顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，HGF組小鼠肺組織AI顯著降低(P<0.001)；與HGF組比較，HGF+LY294002組小鼠肺組織AI顯著升高(P<0.001)(見圖5A，5B)。

圖5 各組小鼠肺組織細胞凋亡情況比較(×400)

討 論

慢阻肺是一種呼吸系統常見病和多發病，慢阻肺發生會引起患者肺功能下降、肺動脈壓力升高，進而引發一系列并發癥，嚴重威脅患者生命健康，當前臨床上該疾病以藥物對癥治療為主，療效有限，尚無明確治愈慢阻肺的有效措施[11]。HGF作為一種多效性生長因子，在肺部上皮細胞和間質細胞的相互作用中發揮著調節功能，同時，還可促進肺支氣管上皮細胞增生和肺上皮組織形成[12]。已有研究報道，腺病毒介導的外源性HGF基因在慢阻肺修復中起一定作用[13]。但HGF作用于慢阻肺的分子機制尚不清楚。

TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC是臨床常用反映肺功能的重要指標，mPAP則是影響慢阻肺預后的重要因素，肺動脈壓力越高，疾病病程越短，病死率越高，早期檢測肺動脈壓力并阻斷PH形成，對慢阻肺的防治以及降低病死率具有指導意義。王偉等研究報道，攜帶外源性HGF基因的腺病毒經支氣管滴入PH家兔模型，可有效降低肺動脈壓力[14]。本研究通過DSP經鼻腔滴入法建立慢阻肺小鼠模型，探究HGF過表達對慢阻肺小鼠肺功能和肺動脈壓力的影響，結果顯示，HGF過表達，顯著改善了慢阻肺小鼠TV、PEF、PIF、FEV0.3、FEV0.3/FVC，肺功能指標水平和mPAP水平。說明 HGF過表達對于改善慢阻肺疾病具有良好的效果。

慢阻肺繼發PH疾病是慢阻肺患者急性加重甚至死亡的主要原因之一[15]，目前臨床認為慢阻肺繼發PH疾病主要與肺血管內皮細胞受損相關，肺內皮細胞受損后，血管調節因子分泌異常，使得血管平滑肌促有絲分裂和抗有絲分裂失衡，導致血管收縮、重塑，肺動脈壓升高[16]。Apelin是一種小分子活性多肽，亦是內源性血管舒張因子，對機體多種細胞和器官具有保護作用[17]。Kleinz等[18]檢測發現Apelin主要存在于肺血管內皮細胞，其在調節肺血管循環穩態方面，具有特殊的生理病理意義。本研究發現慢阻肺小鼠肺組織中Apelin水平明顯降低，HGF過表達可以有效增加小鼠肺組織Apelin分泌，進而調控肺血管循環狀態，改善肺動脈壓力。

大量臨床研究表明細胞凋亡在慢阻肺發病機制中起著重要作用，一方面，慢阻肺患者肺內實質細胞及間質細胞過度凋亡會引起肺部結構發生改變，導致肺氣腫形成；另一方面，肺內炎癥細胞凋亡不足，促使過度激活、聚集致使肺部炎癥持續加劇，最終損害氣道及肺血管內皮功能，導致氣道阻塞及PH發生[19]。PI3K/Akt信號通路是細胞存活、增殖、凋亡的重要信號轉導途徑。PI3K是一種能夠影響細胞多種生物學功能的磷脂酰肌醇激酶，HGF可通過激活PI3K發揮生物學活性，PI3K調節亞基與HGF受體上磷酸化的酪氨酸殘基結合，使PI3K磷酸化得以激活，進而促使PI3K配體Akt轉移至質膜內側，從而磷酸化多種蛋白，發揮調節細胞代謝、影響細胞生存等效應[20-22]。Bcl-2是一種典型的抗凋亡蛋白，在細胞凋亡的各種信號轉導途徑中起著重要的調控作用；有研究表明[23]，細胞凋亡開始時Bcl-2向線粒體中釋放信號，促進凋亡激活Caspase-3，導致DNA斷裂，引起細胞骨架及內膜缺損，直至細胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族成員發生級聯式反應引起細胞凋亡的激活途徑終點，屬于各種凋亡刺激因子被激活的關鍵酶，其水平可反映細胞凋亡的嚴重程度[24]。本研究觀察到慢阻肺小鼠肺組織中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Caspase-3蛋白表達水平顯著升高。HGF過表達能夠顯著改善凋亡相關蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平，逆轉慢阻肺小鼠肺組織細胞凋亡情況；同時，慢阻肺小鼠中HGF過表達能夠促進PI3K/Akt信號通路相關分子磷酸化，而PI3K抑制劑LY294002干預后HGF過表達的作用效果消失，提示HGF通過激活PI3K/Akt信號傳導途徑發揮抗凋亡作用。

綜上所述，HGF可通過增加肺組織Apelin分泌、抑制肺組織細胞凋亡達到改善慢阻肺小鼠肺功能和肺動脈壓力的目的，其作用機制可能由PI3K/Akt信號通路介導。本研究為臨床探索HGF治療慢阻肺提供了新的靶點通路。本研究僅從PI3K/Akt信號通路方向研究了HGF對慢阻肺的作用效果，HGF可能通過其他信號途徑發揮對慢阻肺的作用，還需進一步深入研究。