支氣管哮喘患兒血清miR-34、Notch1水平與氣道炎癥的相關性分析

朱萍 別國梁 司海超

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)是學齡期兒童常見的呼吸系統疾病，以氣急、喘息、咳嗽、胸悶等反復發作為臨床表現，可嚴重影響患兒生活及學習質量[1]。目前，BA發病相關因素尚未解釋完全，但研究認為其與炎性介質、微小RNA(microRNA, miRNA)、炎癥細胞、免疫應答等有關[2]。研究發現，微小RNA-34(microRNA-34, miR-34)miR-34在BA患者中呈低表達，其可能是治療BA的潛在靶標[3]；另外，miR-34與Notch1存在負調控關系，且Notch1在過敏性哮喘中表達上調，其可能參與過敏性哮喘病理發展過程[4-5]。miR-34在BA中雖已有研究，但其在BA患兒中與Notch1的相關性及兩者與氣道炎癥的關系鮮有報道。基于此，本研究通過檢測BA患兒血清miR-34、Notch1表達水平，分析兩者與白介素-17(interleukin-17, IL-17)、嗜酸性粒細胞(Eosinophils, EOS)、白介素-10(interleukin-10, IL-10)等氣道炎癥指標的關系，以期為臨床診斷BA提供依據。

資料與方法

一、 臨床資料

選取2018年10月～2020年5月本院診治的BA患兒94例進行研究(BA組)，其中男52例，女42例；年齡2～12歲，平均年齡(7.28±3.85)歲。并選取同期體檢健康兒童90例進行對照研究(健康組)，其中男54例，女36例；年齡1～13歲，平均年齡(7.63±3.97)歲。健康組與BA組性別比例、年齡差異無統計學意義(χ2=0.413,t=0.607，P均>0.05)。另外，收集兩組家族哮喘史、個人過敏史、家族過敏等資料。BA診斷標準：依據《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》有關BA判定標準進行診斷[6]。納入標準：(1)患者均符合BA診斷標準；(2)患者均具備完整的生理病理檢查資料。排除標準：(1)合并糖尿病、系統紅斑狼瘡或其它自身免疫性疾病者；(2)合并過敏性疾病史、嚴重肝腎疾病者；(3)合并腫瘤者；(4)合并鼻炎、慢阻肺、其他病原體導致的肺部炎癥病變；(5)合并高血壓或其他心血管疾病者。

受試兒童直系親屬簽署知情同意書，所用方法符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會審核批準。

二、方法

1 樣本收集 收集所有患兒入院后，治療前、健康兒童體檢當日清晨空腹外周血約5 mL，分成兩份。一份于室溫下，靜置約30 min，4℃以5200 r/min離心6 min，分離上層血清，置于無菌EP管中，于-80℃冰箱中保存；另一份置于EDTA-K2抗凝管中，混勻，3h內上機檢測EOS水平。

2 qRT-PCR法檢測血清miR-34、Notch1 mRNA表達水平 解凍適量凍存血清樣本，采用Trizol法按Trizol試劑盒(貨號：RP2401，無錫百泰克生物技術有限公司)說明書抽提樣本總RNA。使用紫外分光光度計(型號：DU-730，上海普迪生物技術有限公司)檢測RNA質量。嚴格參照PrimeScript TM RT Master Mix(貨號：RR036A，北京冬歌博業生物科技有限公司)說明書將2.0 μL總RNA逆轉錄為cDNA。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：MA-4800，蘇州雅睿生物技術有限公司)和SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(貨號：HY-K0521，MedChemExpress LLC)完成PCR擴增檢測，其中擴增反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，上/下游引物各1 μL，cDNA 2.0 μL，加ddH2O至總體積為25.0 μL，各引物序列詳(見表1)；另外，程序設定為：97℃預變性6 min；95℃變性15 s，62℃退火20 s，45個循環。反應完成后收集各樣本數據，以2-ΔΔCT法計算miR-34、Notch1 mRNA相對表達量(見表1)。

表1 miR-34、Notch1及內參U6、GAPDH的引物序列

3 ELISA法檢測血清IL-17、IL-10水平 從冰箱中取出IL-17、IL-10 ELISA試劑盒內的標準品，嚴格按其說明書將標準品配制成一系列濃度標準品溶液，應用酶標儀(型號：PT-3502G，北京普天新橋技術有限公司)檢測不同濃度標準品溶液的吸光度，制作IL-17、IL-10的標準回歸曲線；室溫下解凍適量血清樣本，平衡10 min，于酶標板中加血清樣本，37℃培養箱中孵育約30 min，添加生物素工作液(含IL-17/IL-10抗體)，37℃培養箱中孵育約50 min，棄掉反應液，磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)沖洗2次；加顯色液，37℃培養箱中孵育約30 min，加終止反應液，于450nm處測定各樣本的吸光度，計算血清IL-17、IL-10水平。

4 EOS水平檢測 取適量外周血，利用血細胞分析儀(型號：普康 PE-6100，濰坊嘉松醫療器械有限公司)按說明書進行常規操作，檢測EOS水平。

三、統計學方法

結 果

一、兩組一般資料比較

與健康組相比，BA組患兒家族哮喘史、個人過敏史、家族過敏史均明顯升高(P<0.05)，年齡、男/女構成比例無明顯差異(見表2)。

表2 兩組一般資料比較

二、兩組血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比較

與健康組相比，BA組患兒血清miR-34及IL-10水平均降低(P<0.05)，Notch1 mRNA、IL-17、EOS水平均明顯升高(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組血清miR-34、Notch1 mRNA、IL-17、IL-10及外周血EOS水平比較

三、BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達水平與IL-17、IL-10、EOS的相關性

Pearson法分析顯示，BA患兒血清miR-34表達水平與IL-17、EOS呈負相關(P<0.05)，與IL-10呈正相關(P<0.05)；血清Notch1 mRNA表達水平與IL-17、EOS呈正相關(P<0.05)，與IL-10呈負相關(P<0.05)(見表4)。

表4 BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達水平與IL-17、IL-10、EOS的相關性

四、BA患兒血清miR-34表達水平與Notch1 mRNA相關性

Pearson法分析顯示，BA患兒血清miR-34表達水平與Notch1 mRNA呈負相關(r=-0.467，P<0.05)(見圖1)。

圖1 BA患兒血清miR-34表達水平與Notch1 mRNA相關性

五、 影響BA發生的Logistic回歸分析

以miR-34(>0.73=0，0.53～0.73=1,0.23～0.52=2，<0.23=3)、Notch1(<1.28=0，1.28～1.89=1,1.90～2.50=2，>2.5=3)、IL-17(<12.44 ng/L=0，12.44 ng/L～18.54 ng/L=1,18.54 ng/L～24.64 ng/L=2，>24.64 ng/L=3)、IL-10(>12.11 ng/L=0，9.03 ng/L～12.11 ng/L=1,5.95 ng/L～9.02 ng/L=2，<5.95 ng/L=3)、EOS(<0.76 ×109/L=0，0.76 ×109/L～1.17 ×109/L=1,1.18 ×109/L～1.58 ×109/L=2，>1.58 ×109/L=3)、家族哮喘史(無=0，有=1)、個人過敏史(無=0，有=1)、家族過敏史(無=0，有=1)為自變量，以是否發BA為因變量(發生=1，未發生=0)，Logistic回歸分析顯示，miR-34是影響BA發生的獨立保護因素(P<0.05)，Notch1、IL-17、家族哮喘史、個人過敏史、家族過敏史是影響BA發生的獨立危險因素(P<0.05)(見表5)。

表5 Logistic回歸分析發生BA的影響因素

討 論

BA在兒童中多有發生，其以氣道重塑、氣道反應性增高及慢性氣道炎癥為主要特征，可引發肺臟乃至全身反應，對患兒健康成長構成極大威脅[7-8]。因此，尋找與氣道炎癥有關、且可早期診斷、評估BA患兒疾病進展的指標，及時防控BA，對改善患兒生存狀態有積極意義。

miRNA可參與并調控免疫炎癥反應、自噬、信號轉導、機體發育、細胞增殖、凋亡、血管新生等生物過程，與呼吸窘迫綜合征、肺動脈高壓、肺癌、BA等相關[9-10]。研究發現，miR-34作為miRNA家族成員，其在非小細胞肺癌患者血漿中表達異常，miR-34a/c有望成為評估非小細胞肺癌患者預后的標志物[11]；另外，Yin等[3]發現BA患者miR-34表達下調，其可能通過影響自噬、氣道重塑過程，從而在BA病變進展中起重要作用。以上研究表明，miR-34異常表達可能與BA類肺部疾病有關。本研究中BA組患兒血清miR-34表達下調，提示miR-34可能在BA發生發展中具有重要調控作用，究其原因，低水平miR-34可能通過調節機體信號轉導、自噬、炎癥反應等過程，造成其抑制氣道重塑能力減弱，從而影響BA發生發展，但其具體機制有待深入探討。

Notch信號通路在多種組織/器官發育及疾病發生發展中有重要作用，而Notch1是其家族重要成員。研究發現，Notch1在哮喘中呈異常表達，經大豆肽作用后，其表達水平降低，Notch1信號通路可能受大豆肽調節，進而抑制哮喘氣道炎癥反應[12]；此外，盛安群等[5]研究顯示過敏性哮喘中Notch1，與IL-17顯著相關，Notch1可能與炎癥因子相互影響進而在過敏性哮喘中發揮重要作用。以上研究證實，Notch1可能在氣道炎癥類疾病中起重要作用。本研究中BA組患兒血清Notch1 mRNA表達上調，推測，高水平Notch1可能影響相關信號通路表達，加重氣道炎癥反應，從而促進BA發生發展，具體機制需進一步探究證實。

Th17細胞可誘導機體發生炎癥反應，而其分泌的IL-17是影響氣道炎癥反應的重要因子，IL-17可通過活化IL-8、IL-6等細胞因子，募集、活化中性粒細胞，促進多種炎癥因子分泌，導致機體發生炎癥反應[13]；IL-17在BA患者血清中水平明顯增加，其可輔助判定BA患者氣道炎癥程度[14]。IL-10主要是由Treg細胞分泌的抑炎因子，其可活化其它抑炎因子，清除/抑制炎癥部位的EOS，從而減輕炎癥反應[14]；IL-10在BA患兒中表達下調，與BA病情進展有關[15]。此外，氣道局部募集EOS及其介導的炎癥反應是BA發病的重要機制，EOS在BA患者中水平升高，與肺功能、疾病進展程度密切相關[16]。本研究中BA組患兒IL-17、EOS水平升高，IL-10水平降低，與前人研究一致[14-16]，提示IL-17、IL-10、EOS可能通過影響氣道炎癥反應，進而影響BA病變過程，但仍需深入探究具體機制。

本研究中BA患兒血清miR-34、Notch1 mRNA表達水平與IL-17、IL-10、EOS，及miR-34表達水平與Notch1 mRNA均顯著相關，提示miR-34、Notch1可能與IL-17、IL-10、EOS，及miR-34與Notch1影響，進而協同影響BA病理發展，其機制有待深入研究。進一步研究顯示，miR-34是影響BA發生的獨立保護因素，Notch1、IL-17、家族哮喘史、個人過敏史、家族過敏史是影響BA發生的獨立危險因素，提示血清miR-34水平降低、Notch1、IL-17水平升高，伴有家族哮喘史、個人過敏史、家族過敏史均可能增加兒童發生BA風險，及時確定上述指標有利于臨床早期診斷BA。

綜上所述，BA患兒血清miR-34表達下調，Notch1表達上調，兩者呈負相關，且均與氣道炎癥密切相關，及時診斷血清miR-34、Notch1水平，有助于臨床篩查BA患兒。但本研究未深入miR-34、Notch1 mRNA在BA中的具體機制，且樣本量較少，后期將進行探究。