外周血ctDNA及Survivin預測NSCLC預后的臨床研究

齊艷梅 李瑞杰 汪領

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是指源于支氣管黏膜上皮或肺泡上皮的惡腫瘤，屬于常見的肺癌類型，約占肺癌的80%，根據病理類型可分為鱗癌、腺癌、大細胞癌等，臨床典型癥狀表現為咳嗽、咯血、呼吸困難、胸痛等，晚期患者會出現轉移部位相應癥狀，膿胸、病理性骨折等是其常見并發癥，發病率及病死率較高，多數患者確診時已是晚期，預后較差[1-2]。因此，尋找NSCLC預后的相關分子預測指標，為患者制定個體化治療方案具有重要意義。隨著分子生物學技術水平的不斷提高，肺癌分子生物學預后預測指標成為近年來肺癌研究領域的熱點。研究發現，腫瘤患者外周血中的循環腫瘤DNA(circulating tumor，ctDNA)可用于動態監測腫瘤變化、判斷患者預后等[3]。凋亡抑制蛋白存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族的新成員，在多種腫瘤中高表達，與肺癌的發生、診斷和預后密切相關[4]。本研究通過綜合分析NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin表達水平，評估其對患者預后的預測作用。

資料與方法

一、臨床資料

本次研究選取2017年2月—2018年2月收治的138例經病理學檢查確診的NSCLC患者作為研究組。納入標準：①經纖維支氣管鏡或經皮肺穿刺活檢病理確診為原發性NSCLC者；②首次診斷為鱗癌或腺癌且未發生遠處轉移者；③術前未接受任何新輔助放化者；④無手術禁忌證者。排除標準：①患有其它惡性腫瘤、血液系統、神經系統疾病者；②合并嚴重心、肝、腎等器官功能障礙者；③術前發生血栓栓塞性疾病者；④有手術禁忌證者；⑤術前應用抗凝藥物治療者。研究組：男104例，女34例；吸煙96例，不吸煙42例；年齡37～72歲，平均(54.56±10.84)歲；鱗癌67例；腺癌71例；高分化61例，低分化77例；p-TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期96例；淋巴結轉移41例，淋巴結無轉移97例；腫瘤直徑2～7 cm，平均(4.51±2.16)cm。同期，于醫院體檢中心招募56例年齡、性別、吸煙史與NSCLC患者完全匹配的健康志愿者作為對照組，男39例，女17例；吸煙31例，不吸煙25例；年齡35～64歲，平均(53.37±10.26)歲。兩組性別、是否吸煙、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(見表1)。本研究隨訪第一終點為末次隨訪或死亡時間，隨訪方式包括門診復查、電話和信件隨訪，隨訪終止日期為2021年2月。

二、檢測方法

①標本采集與處理：分別收集所有受試者外周血5 mL，經乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理，1500 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，收集血漿保存于-80℃冰箱待用。②ctDNA含量測定：使用血漿游離DNA分離試劑盒依次進行ctDNA大片段分離、小片段回收、DNA末端修復和A接頭連接；提取NSCLC患者血漿ctDNA作為模板進行PCR擴增，反應條件為94℃預變性5 min，95℃退火15 s、60℃延伸30 s，共40個循環，HepG2細胞中提取DNA，倍比稀釋后擴增，上述測量均重復3次，并進行探針雜交捕獲和序列的測序分析。③Survivin mRNA含量測定：根據試劑盒操作說明，應用Trizol提取RNA，使用紫外分光光度計定量并檢測其純度，經瓊脂糖電泳鑒定其完整性，-80℃保存待用；使用1 μg總RNA、2 μL×10緩沖液、2 μL dNTPs(10 mmol/L)、100 ng隨機引物、2 μL M-MLV(10 U/μL)加DEPC水組成20 μL反應體系進行cDNA合成；采用1×定量緩沖液、200 μmol/L dNTPs、5 U ampliTaq Gold、各600 nmol/L的Survivin上、下游引物、200 nmol/L熒光探針、100 ng cDNA組成的50 μL反應體系進行實時熒光定量PCR(qPCR)擴增，以GAPDH為內參照，反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性10 s，然后57℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40個循環，反應結束后，根據標準曲線儀自動進行分析。本研究所用試劑盒購于廈門艾德生物醫藥有限公司，并嚴格按照操作步驟進行操作，逆轉錄反應試劑均購于上海玉博生物科技有限公司，引物序列由天根生化科技(北京)有限公司合成。

三、統計學處理

表1 兩組基線資料比較

結 果

一、NSCLC患者與健康志愿者外周血ctDNA和Survivin mRNA表達水平比較

研究組外周血ctDNA和Survivin mRNA表達水平均高于對照組(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組外周血ctDNA和Survivin mRNA表達水平比較

二、NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表達水平的界限值

根據ROC曲線，患者外周血ctDNA和Survivin mRNA的最佳截點分別為17.23 ng/mL和5.34×105copies/mL(見圖1)。

圖1 確定NSCLC患者外周血ctDNA及Survivin mRNA表達水平界限值的ROC曲線

三、影響NSCLC患者預后的單因素分析

單因素分析顯示，性別、年齡、組織學分型、腫瘤分化程度、淋巴結有無轉移、腫瘤直徑、是否吸煙、術后是否放療及是否使用分子靶向藥物患者的平均生存時間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；術后化療、p-TNM分期Ⅰ～Ⅱ、ctDNA表達水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平<5.34×105copies/mL患者平均生存時間均高于術后未化療、p-TNM分期Ⅲ～Ⅳ、ctDNA表達水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平≥5.34×105copies/mL患者(P<0.05)(見表3)。

表3 影響NSCLC患者預后的單因素分析

四、 Kaplan-Meier生存曲線分析NSCLC患者外周血ctDNA、Survivin mRNA表達水平與預后的相關性

外周血ctDNA表達水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平≥5.34×105copies/mL患者與外周血ctDNA表達水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平<5.34×105copies/mL患者生存曲線比較，差異均有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 外周血ctDNA及Survivin mRNA表達水平與NSCLC患者預后關系

五、影響NSCLC患者預后的COX多因素分析

將單因素分析中有統計學意義的p-TNM分期、術后是否化療、ctDNA表達水平、Survivin mRNA表達水平因素納入COX比例風險模型進行多因素分析，結果顯示p-TNM分期、ctDNA表達水平、Survivin mRNA表達水平均是影響NSCLC患者預后的獨立危險因子(P<0.05)(見表4)。

表4 影響NSCLC患者預后的COX多因素分析

討 論

NSCLC是病死率較高的惡性腫瘤之一，以65歲以上人群居多，但近年來發病有年輕化趨向，其確切病因尚未完全明確，可能與環境因素、自身因素和遺傳因素有關[5]。臨床上常通過手術切除、放射治療、化學治療、靶向治療、免疫治療等一系列手段進行綜合治療，但5年生存率無明顯提高，多數患者仍死于肺癌的局部復發或遠處轉移[6]。因此，精準評估肺癌患者的預后，從而積極采取個體化的肺癌治療這一問題亟待解決。隨著分子病理學研究的進展，越來越多的研究發現檢測相應分子標志物的突變基因進而選擇最佳靶向藥物對肺癌的治療具有非常重要的指導作用[7]。

外周血是最常使用的液體活檢標本之一。本研究結果顯示，NSCLC患者外周血ctDNA與Survivin mRNA表達水平明顯高于正常對照組，提示NSCLC患者外周血ctDNA與Survivin mRNA表達異常。ctDNA是腫瘤細胞DNA經脫落或細胞凋亡時釋放入外周血的小片段DNA，大小通常為160～180 bp，包含了腫瘤組織的全部遺傳信息，與原發腫瘤DNA具有相同的特征，可反應腫瘤組織中基因的突變狀態，實現實時監測，從而指導患者的靶向治療，改善患者預后[8]。越來越多的研究表明，ctDNA在腫瘤的早期診斷、療效評估、復發監測及預后判斷等方面具有重要意義。Rolfo等[9]認為血漿中循環細胞腫瘤DNA的分離和分析技術是一種強大的工具，具有巨大潛力，可以改善包括NSCLC在內的多種癌癥類型的臨床結果。陳學瑜[10]等使用突變擴增阻滯系統法檢測77例NSCLC患者外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變情況，結果發現NSCLC患者外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變率、突變位點比較均無明顯差異，認為NSCLC患者ctDNA中EGFR基因突變與腫瘤組織中EGFR基因突變具有較好的一致性，預后效果良好，可作為判斷患者預后的重要預測指標。

腫瘤的發生發展是一組多基因突變、多階段的綜合病理過程，是多種基因表達及積累的結果，而凋亡基因的改變是其中一個非常重要的環節[11]。人類Survivin基囚定位于第17對染色體的q25帶，長度為75～130 kb，包含多個轉錄起始位點，具有抑制細胞凋亡和調節細胞分裂雙重功能，在多數癌組織中均有表達，通過直接促進細胞逃離生長監控，造成細胞增殖增加，凋亡減少，二者之間的平衡被打破，最終導致腫瘤的發生[12]。Duan等[13]進行了Survivin蛋白表達參與亞洲人非小細胞肺癌進展的薈萃分析，該薈萃分析共納入28篇文獻，結果表明，NSCLC患者和正常對照之間survivin陽性表達存在顯著差異，且survivin表達與組織學分化、腫瘤分期和淋巴結轉移相關，認為Survivin表達與NSCLC的臨床病理特征有關，可能是NSCLC進展的重要生物標志物。

本研究根據ROC曲線分析確定了NSCLC患者外周血ctDNA和Survivin mRNA表達水平界限值分別為17.23 ng/mL、5.34×105copies/mL，單因素分析顯示，術后是否化療、p-TNM分期、ctDNA與Survivin mRNA表達水平均是影響NSCLC患者預后的相關因素，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，外周血ctDNA表達水平≥17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平≥5.34×105copies/mL患者3年累積生存率均高于ctDNA表達水平<17.23 ng/mL、Survivin mRNA表達水平<5.34×105copies/mL患者，再次表明外周血ctDNA及Survivin表達情況與NSCLC患者的預后關系密切。原因在于，ctDNA是腫瘤細胞釋放到血液中的單鏈或雙鏈DNA，攜帶有原始腫瘤的突變基因，可用于監測患者術后微小病灶的殘留，并評估腫瘤復發的相關風險，故可作為預測NSCLC患者預后的分子指標[14]。Survivin蛋白表達越高，其對癌細胞凋亡抑制的能力越強，癌細胞的生存能力也相應增強，導致腫瘤復發和淋巴結轉移，預后較差，因此可作為預測NSCLC患者預后的分子指標[15]。此外，本研究COX多因素分析顯示，p-TNM分期、ctDNA表達水平、Survivin mRNA表達水平均是影響NSCLC患者預后的獨立危險因子，再次表明外周血ctDNA與Survivin mRNA表達水平與NSCLC患者預后具有密切關系。

綜上所述，外周血ctDNA與Survivin均在NSCLC患者中高表達，與患者預后關系密切，可作為預測患者預后的分子指標。但本研究僅對ctDNA與Survivin單獨預測作用進行分析，后續需行大樣本、多中心的臨床試驗，以進一步評估多種指標聯合檢測在預測NSCLC患者預后方面的效能及價值。