Moesin調(diào)控肺癌A549細胞增殖、侵襲的實驗研究

張若琛 陳義坤 祝清清 張偉杰 黃建安

Moesin是ezrin-radixin-moesin (ERM)家族蛋白成員之一，它連接肌動蛋白細胞骨架和跨膜受體。ERM在不同物種之間高度保守[1]，其在調(diào)節(jié)細胞表面結構，如微絨毛和膜皺褶，以及特殊的膜結構域中起著關鍵作用[2-3]。ERM蛋白以單體或二聚體的形式存在于靜止狀態(tài)，可以通過磷脂或激酶介導的磷酸化誘導的構象變化來調(diào)節(jié)其功能，從而導致蛋白質(zhì)的激活[4]。Moesin在多種癌癥中表達上調(diào)，包括乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胰腺[7]、肺癌[8]和黑色素瘤[9]，并且其高表達與不良預后相關。

目前尚無關于Moesin對肺癌增殖轉移作用的研究。本文旨在探索Moesin在非小細胞肺癌中的作用及其機制。

資料與方法

一、一般材料

1 細胞株 從中國科學院細胞庫(上海)采購人NSCLC細胞A549、SPC-A1、HCC827、PC9、H1975(肺腺癌細胞系)、H226(肺鱗癌細胞系)H460(大細胞肺癌細胞)和BEAS-2B(人永生化正常上皮細胞)。

2 主要儀器 電泳儀(Bio-Rad)、顯微鏡(Olympus)、移液槍(Eppendorf)、超凈工作臺(中國蘇凈安泰公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)、50 mL塑料培養(yǎng)瓶(Corning)、Transwell 小室(Corning)、24孔培養(yǎng)板(Corning)。

3 主要試劑 細胞培養(yǎng)基RPMI-1640(Hyclone)、胰酶(Cell Signal Technology)、無血清細胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司)、蛋白酶/磷酸酶抑制劑(Hyclone)、Anti-Moesin antibody(Abcam)、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為試劑生物科技有限公司)、結晶紫(上海生工生物工程技術有限公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

4 RNA干擾序列 si-RNA干擾序列如下：siMoesin-1：5′-GGAUCUUGGCCUUGUGCA UTT-3′, siMoesin-2： 5′-GGGCUGAUGCUAUGGCCAATT-3′。

二、方法

1 細胞培養(yǎng) 細胞在添加10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)和L-谷氨酰胺的RPMI-1640中，在標準細胞培養(yǎng)條件下(5%CO2/37℃)培養(yǎng)。

2 RNA干擾 在500 μL空白培養(yǎng)基中分別加入5 μL干擾序列及轉染試劑lip2000，震蕩離心后混勻，靜置10 min。感染細胞后48 h后進行后續(xù)實驗。

3 CCK-8法檢測細胞增殖能力 在標準細胞培養(yǎng)條件下，以每孔3×103個細胞的濃度在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞。用CCK-8試劑盒在24、48和72 h后分別用酶標儀檢測450nm和630nm的光密度值(OD值)。根據(jù)檢測結果繪制生長曲線。

4 Transwell 在細胞遷移/侵襲實驗中，分別接種3-6×104細胞于含有200 μL 1%培養(yǎng)基Transwell小室中，下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。在標準細胞培養(yǎng)條件(5%CO2/37℃)下培養(yǎng)24 h后用甲醇固定30 min，1 mL結晶紫過夜染色，后用PBS清洗1～2遍。用顯微鏡拍照計數(shù)，放大倍數(shù)為200X。

三、統(tǒng)計分析

結 果

一、STARBASE、OSluca 數(shù)據(jù)庫分析非小細胞肺癌患者中，Moesin高表達與不良預后相關(見圖1)。

圖1 Moesin高表達與非小細胞肺癌患者不良預后相關

二、Moesin在肺癌細胞系中的表達

用Western blot檢測正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B以及8個肺癌細胞系中的moesin蛋白的表達(圖2)。與正常細胞相比，moesin在肺癌細胞株中表達顯著上調(diào)。選取表達量中等的A549進行后續(xù)實驗。

圖2 Moesin在肺癌細胞系中的表達

三、干擾Moesin可以抑制細胞轉移

在A549細胞株中，通過Tranwell法檢測顯示，敲弱組的遷移以及侵襲能力明顯降低，計數(shù)顯示差距具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A)。通過Western blot法檢測干擾moesin后，EMT(上皮間充質(zhì)轉化)蛋白標志物的表達情況。可以看到，與對照組相比，干擾組Vimentin, N-cadherin表達均下調(diào)，E-cadherin,表達上調(diào)(圖3B、C)。

圖3 干擾Moesin對A549細胞轉移及上皮間充質(zhì)轉移標志物的影響

四、干擾moesin可以抑制細胞增殖

在A549細胞株中，通過CCK-8法檢測顯示，敲弱組的增殖能力明顯降低，計數(shù)顯示差距具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4A)。通過Western blot法檢測干擾moesin后，與增殖相關的蛋白標志物的表達情況。已有文獻報道，AKT,ERK信號通路可以調(diào)劑腫瘤細胞增殖[10]。可以看到，與對照組相比，p-AKT, p-ERK表達均下調(diào)，而總蛋白并無明顯變化(圖4B、C)。

圖4 干擾Moesin對A549細胞增殖及增殖標志物的影響

討 論

本研究表明，Moesin在多種癌癥中表達上調(diào)。

在非小細胞肺癌中，其高表達與肺癌患者分期及不良預后相關。并且，Moesin可促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。并且揭示其通過下游AKT, ERK, EMT信號通路從而影響細胞表型。

已有文獻報道，在HCC827細胞株中，Moesin可以介導Snail誘導的EMT相關的P-糖蛋白活性的增加，從而增加對紫杉醇的耐藥性。本研究已證實Moesin可通過EMT通路影響細胞轉移。EMT是細胞從極化上皮表型向間充質(zhì)成纖維細胞樣表型轉變的生物學過程[11]，它可以下調(diào)E-cadherin等上皮蛋白的表達，上調(diào)N-cadherin，Vinmentin等間充質(zhì)蛋白的表達[12]。同時，EMT也是EGFR-TKI耐藥機制之一[13-14]。這揭示Moesin蛋白在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。

在乳腺癌中，磷酸化Moesin與E3泛素連接酶SPOP競爭性結合PD-L1，從而穩(wěn)定PD-L1蛋白[15]。近十年來，檢查點阻斷免疫治療的發(fā)展取得了顯著進展，特別是針對非小細胞肺癌PD-1和PD-L1的藥物[16]。這給我們在非小細胞肺癌中，Moesin具體作用機制提供了研究的新思路。

Moesin的作用提示其可能與相關基因的靶向治療存在潛在聯(lián)系，其機制還需要我們進一步探索，助于我們找到癌癥靶向治療新的生物標志物。