人臍帶間充質干細胞治療肺部疾病的研究與應用進展

蔣楊 陳博 王賢君 陳彥昕 朱桐 薛原野 王巧燕 周艷芳

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早起源于早期中胚層，能夠自我更新并具有多向分化的潛能，能在成體骨髓、牙髓、脂肪組織、臍帶等組織中分離[1]。與其他組織來源的MSCs相比，人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是從人臍帶的華通氏膠(WJ)、人臍帶血、人臍帶血管周圍組織、羊膜中分離出來的間充質干細胞，取材簡單，來源廣泛，基本不受倫理學的限制，具有免疫原性低、免疫調節能力強、更易體外擴增等特點，同時還具有胚胎干細胞及成體干細胞的優點，逐漸成為組織工程和再生醫學中最具發展前景的種子細胞[2]。

目前，hUCMSCs越來越多地被研究和應用在治療肺部疾病方面，研究發現其主要通過以下幾個方面的功能來治療肺部疾病的(如圖1)：(1)歸巢作用：hUCMSCs具有向炎癥或損傷部位歸巢的特點，且經靜脈注射后首先歸巢于肺中，能更好地發揮其治療肺部疾病的作用。(2)抑制炎癥反應：hUCMSCs能通過降低炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等和升高抗炎因子如白細胞介素4(IL-4)等減輕肺部炎癥。(3)促組織修復與再生：hUCMSCs通過分泌功能和分化功能來促進組織修復與再生。分泌功能主要是分泌生長因子和外泌體，如：表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)等，這些因子在調節組織損傷修復與再生的過程中發揮關鍵作用。分化功能主要是hUCMSCs可分化為Ⅰ型、Ⅱ型肺泡細胞，修復損傷的肺組織。(4)免疫調節：hUCMSCs能通過改變樹突狀細胞(DCs)、T細胞、自然殺傷(NK)細胞分泌的細胞因子，從而誘導產生更多的抗炎和耐受表型，對免疫排斥和炎癥起著調節作用。(5)作為基因、因子傳遞載體：hUCMSCs能攜帶相應基因在相應部位高效地表達，在放大藥物作用的同時減少多種毒副作用，如能攜帶血管緊張素轉換酶2(ACE2)、血管生成素1(Ang1)、干擾素-β(IFN-β)等。因此，本文對hUCMSCs在治療肺部疾病的研究與應用進展方面進行綜述。

圖1 hUCMSCs的功能及作用特點

hUCMSCs治療急性肺損傷

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)及其嚴重形式急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由創傷、輸血、感染等多種因素所導致的急性進行性呼吸功能不全或者呼吸衰竭癥狀，是臨床上較為常見的危重癥之一，病死率較高。炎癥反應和肺組織損傷是ALI的發病基礎。肺泡巨噬細胞是呼吸道的重要防線，也是損傷時的主要效應細胞，hUCMSCs能誘導巨噬細胞向M2型極化，而M2型巨噬細胞可減輕炎癥反應，促進組織修復和再生，從而有效緩解ALI。其作用機制有研究報道是通過PGE2途徑誘導[3]的，還有研究報道是通過旁分泌作用調節的，如分泌的核心蛋白聚糖(DCN)可通過CD44誘導巨噬細胞向M2型極化[4]，又如分泌正五聚蛋白3(PTX3)，增強巨噬細胞向M2型極化，還提示PTX3是預測hUCMSCs治療炎癥性疾病的潛在標記物，使用PTX3進行質量控制，有助于提高hUCMSCs的治療效果。

在ALI中還涉及到多種信號通路的激活和抑制，靶向調控ALI中的信號通路，有可能成為新的治療途徑。核轉錄因子κB(NF-κB)通路，在機體炎癥反應過程中起核心作用，hUCMSCs能降低血漿促炎因子水平，顯著抑制CyPA的表達，阻斷NF-κB通路而減輕ALI[5]。

近年來，越來越多的研究表明，來自hUCMSCs的外泌體(hUCMSCs-EXOs)在ALI中發揮了有益的作用。外泌體是一種小囊泡，通過傳遞RNA、蛋白質和miRNAs37在細胞通訊中發揮重要作用。它衍生的miR-451也能抑制TLR4/NF-κB通路，降低炎癥因子水平，減輕ALI[6]。hUCMSCs還能抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路，減輕氧化應激、炎癥反應，從而減輕ALI[7]。hUCMSCs還能通過抑制肺組織同源蛋白3(TRB3)mRNA的表達，減輕ALI的炎癥反應[8]。

將hUCMSCs作為某些基因、細胞因子等的載體用于治療ALI，也是較為有效的治療方式。攜帶血管緊張素轉換酶2(ACE2)基因的hUCMSCs尾靜脈注射移植能有效降低ALI大鼠肺部中性粒細胞浸潤和總蛋白滲出，改善血管通透程度，降低肺組織中促炎因子水平，提升抗炎因子IL-4及ACE2的表達，從而減輕ALI大鼠病理損傷程度[9]。攜帶血管生成素1(Ang1)基因的hUCMSCs也能改善ALI的全身炎癥反應和肺泡通透性[10]。核心蛋白聚糖(DCN)修飾的hUCMSCs可明顯減輕放射性肺損傷的急性炎癥反應，明顯抑制后期纖維化，其機制可能是通過誘導干擾素-γ(IFN-γ)的表達，抑制肺組織Ⅲ型膠原α1的表達，降低調節性T細胞(Tregs)來增強的hUCMSCs的功能[11]。高表達趨化因子受體4(CXCR4)的hUCMSCs不僅改善了肺組織病理學改變，通過降低輻射誘導的外周血基質細胞衍生因子1(SDF-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原和E-鈣黏素(E-cadherin)的表達，增強hUCMSCs對放射性ALI的保護作用[12]。高表達超氧化物歧化酶2(SOD2)的hUCMSCs能降低支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白水平，下調肺組織中NF-κB p65和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白的表達，上調SOD1、SOD2、血紅素氧合酶-1(HO-1)和核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)的表達，有效地減輕了大鼠ALI[13]。

hUCMSCs治療肺癌

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，最常見的組織學類型是肺腺癌，占肺癌患者的50%。hUCMSCs是治療實體腫瘤的潛在工具，然而，hUCMSCs在肺癌的研究卻有許多相反的報道。有不少研究從不同方面報道hUCMSCs有促進肺癌細胞增殖的作用。肖恒等[14]發現在荷瘤動物實驗中hUCMSCs會發生自我惡性轉化，并促進肺腺癌A549細胞移植瘤的生長與轉移，其機制尚不明確。在異種移植瘤模型中，hUCMSCs衍生的胞外小泡(hUCMSCs-EVs)能直接作用于肺腺癌細胞，促進肺腺癌細胞的生長[15]。體外實驗也發現，hUCMSCs在缺氧條件下能使缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和生存素(Survivin)表達上調，從而使肺腺癌A549細胞的增殖和遷移能力增強。

但也有不少研究表明hUCMSCs能誘導肺癌細胞的凋亡。袁哲等[16]證實hUCMSCs能抑制PI3K/AKT信號通路而抑制肺腺癌A549細胞的增殖，促進細胞凋亡。hUCMSCs還能抑制肺癌細胞H1299侵襲，誘導H1299細胞凋亡，但對H1299細胞增殖和細胞周期進程無明顯影響[17]。還有研究[18]發現hUCMSCs能與肺腺癌A549細胞發生融合，將A549細胞阻滯在G0/G1期，減弱了A549細胞的遷移能力，并通過下調B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶7(Caspase-7)前體、β連環蛋白(β-catenin)和人髓細胞增生原癌基因(C-myc)，上調酪氨酸蛋白激酶A5受體(Eph A5)，誘導其凋亡。

目前研究發現將hUCMSCs作為抗癌藥物的靶向載體，攜帶某些基因、細胞因子及趨化因子等作用于腫瘤，是較為有效的新的治療手段。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)具有選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的優點。在TRAIL蛋白N末端增加肺表面活性蛋白-D(SPD)結構域，使其形成十二聚體結構，增強抗腫瘤活性及穩定性，攜載SPD-TRAIL基因的hUCMSCs可以穩定的高表達TRAIL蛋白，并對肺腺癌A549細胞有顯著的抑制增殖和促凋亡作用[19]。還有研究在可溶性TRAIL(sTRAIL)的N端加上異亮氨酸拉鏈(ISZ)，可生成三聚體TRAIL(ISZ-sTRAIL)，增強其抗腫瘤活性，并通過hUCMSCs，將ISZ-sTRAIL特異性地運送到腫瘤部位，該靶向治療系統在小鼠異種移植模型中顯示出良好的凋亡誘導和抗腫瘤潛能，且無明顯副作用[20]。此外，hUCMSCs負載干擾素-β(IFN-β)基因慢病毒載體，能體外分泌具有生物活性的IFN-β，顯著抑制A549和H226的克隆形成、遷移及增殖能力[21]。但是，hUCMSCs作為基因、細胞因子等的載體，其效率和穩定性也需更深入的研究。

hUCMSCs治療肺纖維化

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以成纖維細胞異常增殖和細胞外基質大量沉積并伴有彌漫性炎癥、肺組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。PF的逆轉需要抑制炎癥、促進膠原降解和刺激肺泡再生，而hUCMSCs不僅能調節免疫反應，還能合成和釋放透明質酸，促進肺再生，已被廣泛研究，并應用于臨床試驗中。目前，很多實驗研究向著優化治療效果方面探討，如重復給藥，聯合用藥等。有研究[22]發現大劑量移植hUCMSCs能顯著修復大鼠PF，改善了血氧飽和度水平和呼吸頻率。進一步發現，其能逆轉肺泡損傷，減少細胞浸潤，改善膠原沉積，減少了肺炎癥上皮-間充質轉化，促進了巨噬細胞基質金屬肽酶-9(MMP-9)與Toll樣受體-4(TLR-4)的表達和膠原降解，促進肺泡再生。在共培養研究中，hUCMSCs升高肺巨噬細胞MMP-9水平，釋放透明質酸到培養液中，并刺激肺泡上皮中TLR-4的表達。該研究還發現移植后1個月，大鼠肺內的hUCMSCs仍然存活，并分泌細胞因子，未分化為肺泡或血管上皮細胞。該結果證明移植的hUCMSCs在大鼠肺內長期存活，并能有效逆轉大鼠肺間質纖維化。陳志軍等[23]針對一次性使用hUCMSCs治療PF的局限性，設計了不同時間點，4次重復給藥治療大鼠矽肺PF，發現無論在以肺泡炎為主的階段還是在以纖維化為主的階段進行治療，均有抗纖維化效果，能有效減輕矽塵導致的大鼠PF，其機制可能是通過下調TGF-β1、IL-6的水平實現。吳羨等[24]經尾靜脈注射hUCMSCs聯合低劑量吡非尼酮(PFD)灌胃治療小鼠PF，結果顯示，hUCMSCs聯合PFD明顯延長了小鼠的生存時間，肺部蜂窩樣改變明顯減少，肺內膠原沉積減低，肺纖維化標志物Col1a1、Col1a2水平顯著降低，抑制肌成纖維細胞(MFB)增殖，而且聯合用藥后，低劑量的PFD能發揮優于其3倍甚至10倍劑量的抗纖維化作用，提示hUCMSCs與PFD聯合療法，既可增強PFD抗纖維化療效、又可降低PFD的用量，減少不良反應發生率，增強PF患者的耐受性與依從性。還有研究[25]表明hUCMSCs外泌體(hUCMSCs-EXOs)可抑制小鼠PF的發展，顯著降低PF小鼠的肺系數、改善肺組織切片膠原沉積和肺組織病理變化，其機制是通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路激活的上皮-間質轉化而緩解小鼠肺纖維化程度，且在造模后第2天給藥時抑制作用更為明顯。

臨床上使用hUCMSCs治療PF也不乏報道，譙智慧等[26]用hUCMSCs治療8例放射性肺纖維化(RPF)患者，結果表明是安全和有效的，能夠減輕患者的臨床癥狀和降低肺纖維化密度，對患者的肝腎等主要臟器無損害，其機制可能是通過降低TGF-β1水平抑制纖維化的形成。還有研究[27]報道了用hUCMSCs治療正在接受長期氧療的重癥特發性肺纖維化(IPF)1例，患者接受hUCMSCs靜脈輸注，隨訪12個月，在移植前后都進行了臨床和運動測試，以及生活質量的問卷調查，12個月結束時，患者在體能、生活質量和呼吸參數方面均有改善，表明hUCMSCs靜脈輸注對IPF患者是有益的。

hUCMSCs治療新冠肺炎

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19，簡稱新冠肺炎)是由新型冠狀病毒2019-nCoV感染引起的傳染性疾病。國內外新冠肺炎的細胞治療主要集中在間充質干細胞(MSCs)和自然殺傷(NK)細胞上。應用最多的是MSCs，其中hUCMSCs具有強大的雙向免疫調節功能和抑制炎癥反應，能抑制新冠肺炎引發的細胞因子風暴，且不表達血管緊張素轉換酶受體Ⅱ而對冠狀病毒天然免疫，為臨床治療新冠肺炎奠定了基礎。國內首次[28]及連續[29-30]報道了使用異體hUCMSCs聯合抗病毒等方法治愈4例新冠肺炎重癥患者，2例進行了3次靜脈輸注，3 d 1次，1例每次5×107個細胞，1例每次1×106個細胞/kg，另外2例進行了2次靜脈輸注，隔間5d，按1×106個/kg體重的劑量，均以40滴/min的速度靜脈滴注細胞。治療結果顯示，靜脈輸注hUCMSCs能降低新冠肺炎患者炎癥因子IL-6、C反應蛋白(CRP)、血清膽紅素等指標的水平，白細胞和中性粒細胞數量下降，淋巴細胞數量上升，中性粒細胞/淋巴細胞的比值持續下降，并指出中性粒細胞/淋巴細胞比值是能反映新冠肺炎患者炎癥狀況好轉的更顯著指標[31]；同時，T細胞、NK細胞和B細胞的絕對值持續上升，CT影像結果顯示肺部的炎癥反應明顯減輕，新型冠狀病毒核酸檢測連續2次陰性，最終達到治愈標準出院，隨訪1個月未見不良反應。而近期的一項Ⅰ期臨床試驗結果也表明[32]，中重度新冠肺炎患者靜脈輸注hUCMSCs是安全的，耐受性良好。

目前，國內多個省市的醫療和科研機構都先后開展了hUCMSCs治療新冠肺炎的相關臨床研究，如湖北省的《人臍帶間充質干細胞治療新型冠狀病毒重癥肺炎的臨床研究》、湖南省的《臍帶間充質干細胞治療新型冠狀病毒肺炎關鍵技術攻關與臨床應用示范》等，表明了hUCMSCs在新冠肺炎的治療方面具有良好的臨床應用前景，但受限于樣本量小、隨訪時間短等因素，還需要進行長期隨訪的Ⅱ/Ⅲ期隨機對照雙盲試驗，以評估hUCMSCs在減少重癥新冠肺炎患者死亡和改善長期治療結果方面的治療作用，同時在臨床試驗設計方面還需考慮到受試者選擇、安全性和療效評價及風險控制等問題。

hUCMSCs治療慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種慢性炎癥過程和蛋白酶-抗蛋白酶失衡，主要由香煙煙霧引起，導致氣流受限和肺泡破壞，發病率和死亡率都很高。動物實驗研究表明hUCMSCs對香煙煙霧誘發的COPD動物模型有療效，能減輕肺部炎癥，使肺組織中CXCL1/KC和MMP-12降低，血清IL-17A、TNF-α和IL-1β也明顯降低。一項臨床試驗表明[33]，同種異體hUCMSCs移植治療20名中重度COPD患者是安全的，能降低COPD評估測試和加重次數，顯著改善他們的生活質量，并隨訪6個月，為后續的細胞治療研究提供了基礎。但針對上述臨床試驗的一項評論[34]卻指出該試驗與另外三個“失敗”的臨床試驗有著相似的臨床結果，就是COPD患者的肺功能沒有明顯改善。因此，只有通過嚴格的對照試驗才能確定MSCs特定細胞類型對治療COPD的適宜性和有效性。而MSCs是否能夠在COPD患者中實現氣體交換的結構和功能恢復，以及通過何種機制，仍需進一步研究。

hUCMSCs治療肺發育不良

支氣管肺發育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產兒常見的慢性肺部疾病，死亡率較高。hUCMSCs具有強大的免疫調控能力和多向分化能力，能自體移植及同種異體移植，降低異體移植的風險。動物實驗證明[35]尾靜脈注射hUCMSCs對高氧誘導新生大鼠BPD模型有治療作用，大鼠氧依賴得到緩解，肺泡結構明顯改善。還有研究表明[36]hUCMSCs能改變BPD大鼠肺組織DNA甲基化水平來減輕肺組織的炎癥反應和修復損傷肺組織，主要是通過降低Cldn18和Lep的甲基化水平來實現的。目前，hUCMSCs在臨床上治療BPD已取得了一定的效果[37]。國外的Ⅰ期臨床試驗[38]表明氣管內注入hUCMSCs治療BPD，具有較好的療效，肺泡灌洗液中炎癥因子水平顯著降低，隨訪至84d無不良反應出現。Ⅱ期臨床試驗[39]表明氣管內注入hUCMSCs是安全的，出院后均無需接受氧療，隨訪至糾正年齡2歲時未出現生長發育遲緩及神經系統并發癥等不良反應。國內的一項臨床研究也表明[40]，在患兒出生后7d、14d分別給予氣管內滴入hUCMSCs 1×107個/2mL生理鹽水，治療后MIF、CD105、TGF-β1、IL-8等細胞因子水平明顯降低，保護性細胞因子PLTP 則明顯升高，而平均住院時間、用氧時間及1歲內發生肺炎的機率明顯低于對照組，出生后28d內的體質量增長，明顯高于對照組，提示使用hUCMSCs防治BPD安全有效、值得推廣。但還是需要更多的多中心、大規模的臨床試驗來證實其安全性和有效性。

結 語

目前的研究表明，hUCMSCs通過歸巢作用、抑制炎癥反應、損傷組織修復、免疫調節及作為基因、因子傳遞載體來治療肺部疾病的。雖然目前對hUCMSCs的作用機制的研究還不夠深入，但其治療肺部疾病的有效性和安全性已在相關的基礎研究、臨床前和臨床試驗中得到了初步的驗證，具有較好的研究價值和應用前景。但在臨床應用中仍要注意一些問題，如移植的最佳劑量，接受移植的最佳時間，以及注射速率、移植頻率及長期移植的副作用等，需要進一步地深入研究探討。