鋅指蛋白703在卵巢上皮性漿液性腫瘤中的表達及臨床意義

王爽，汪彩霞，李瀟，劉鷗萱，胡悅欣，勾睿，聶鑫，郭騫，朱連成，林蓓

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004；2.遼寧省母胎醫學重點實驗室，遼寧省婦產科學重點實驗室，沈陽 110004；3.四川大學華西第二醫院婦產科，成都 610041）

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其發病隱匿，早期缺乏特異的診斷方法，大部分患者被確診時已處于腫瘤晚期，并且在世界范圍內，卵巢癌發病率仍呈上升趨勢［1-2］。上皮性漿液性腫瘤是卵巢惡性腫瘤中最常見的類型之一。鋅指蛋白703（zinc finger protein，ZNF703）屬于NET/Nlz家族成員，是一種具有“指狀”結構域的轉錄因子［3］。在生理情況下，ZNF703調控胚胎發育過程，如脊椎動物后腦分化為菱腦節及非洲爪蟾神經嵴等［4-5］。目前的研究證實，ZNF703在乳腺癌［6］、肺癌［7］、胃癌［8］中的表達異常升高，有促進腫瘤進展的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

卵巢組織樣本共81例，包括其中卵巢上皮性漿液性腫瘤45例（漿液性癌組），卵巢上皮性漿液性交界腫瘤12例（交界組），卵巢上皮性漿液性良性腫瘤13例（良性組）和正常卵巢組織11例（正常組）。樣本取自中國醫科大學附屬盛京醫院婦科2008年至2014年間住院患者手術標本存檔蠟塊，所有病例術前均未經過化療、放療或激素治療，且具有完整的臨床信息。正常的卵巢組織來自非育齡患者，因宮頸部病變而接受了全子宮切除術。結果由2位不知情的高年資病理醫師獨立判斷，如有異議由第3位病理醫師判定。各組年齡比較，差異無統計學意義。本研究獲得中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準，倫理批號：2019PS450K。

1.2 主要試劑

鼠抗人ZNF703抗體（sc-271896購自美國SantaCruz公司），鼠兔通用型免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司，蘇木素購自上海碧云天生物技術公司。

1.3 檢測方法

石蠟切片為5 μm厚度連續切片。其中，以ZNF703陽性表達的腎上腺組織切片為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作陰性對照片，ZNF703單克隆抗體作用濃度為1∶50。脫蠟后，采用免疫染色通透液（Triton X-100，P0096，Beyotime）通透，染色方法按鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法試劑盒說明書進行。

1.4 染色結果判定標準

結果以細胞核、細胞質有棕黃色顆粒著為陽性。按著色強度分為不著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色，并分別記分為0、1、2及3分；著色細胞所占視野的百分比為＜5%，5%～＜25%，25%～＜50%，50%～75%及＞75%分別記為0、1、2、3及4分。2項相乘得到最終評分，0～2分為（-），3～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。由2位觀察者分別閱片控制誤差。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件系統進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗及 Fisher確切概率法，計量資料采用單因素方差分析。2組之間的統計差異通過t檢驗進行比較，2組以上比較采用單因素方差分析。Kaplan-Meier曲線用于生存分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達

為了評估卵巢漿液性腫瘤患者中ZNF703的表達，本研究對臨床標本的石蠟切片進行了免疫組織化學染色。結果顯示，ZNF703主要表達于卵巢組織的細胞核中，在細胞質中也有表達（圖1）。卵巢漿液性癌組陽性表達率和高表達率分別為86.7%（39/45）和62.2%（28/45），高于交界組［66.7%（8/12）和33.3%（4/12），P均＞0.05］，顯著高于良性組［46.2%（6/13）和7.7%（1/13），均P＜ 0.05］和正常［27.3%（3/11）和0%（0/11），P均＜0.001］組。在卵巢交界性漿液性腫瘤組中，ZNF703陽性表達率為66.7%（8/12），高表達率為33.3%（4/12），高于良性組［46.2%（6/13）和7.7%（1/13）］和正常組［27.3%（3/11）和0%（0/11）］（P均＞0.05），見表1。

表1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達Tab.1 ZNF703 expression in various ovarian tissue types

圖1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達情況Fig.1 ZNF703 expression in ovarian tissues samples

2.2 ZNF703表達與卵巢漿液性惡性腫瘤臨床病理參數的關系

將45例卵巢漿液性癌分為ZNF703高表達組（++/+++）和ZNF703低表達組（-/+），ZNF703的表達與臨床病理病理參數的關系如表2所示，ZNF703的表達與臨床病理分期相關（P＜ 0.05）。但ZNF703表達水平與淋巴結轉移及分化程度均無明顯相關性，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表2 ZNF703表達與卵巢漿液性惡性腫瘤臨床病理參數的關系Tab.2 Relationship between ZNF703 expression and clinicopathological parameters of ovarian serous malignant tumors

2.3 ZNF703的表達與卵巢漿液性惡性腫瘤患者預后的關系

對45例卵巢惡性腫瘤患者進行隨訪，Kaplan-Meier生存分析結果顯示，高表達ZNF703的卵巢漿液性癌患者總生存期較ZNF703低表達的患者短（P=0.011）（圖2A）。免疫組化評分如圖2B所示。同時，查閱Oncomine數據庫，發現ZNF703在多種腫瘤中均為高表達，在卵巢癌中尚無研究（圖2C）。進一步采用Cox回歸分析探討不同臨床病理參數及指標與預后的關系，單因素分析結果顯示，ZNF703的高表達、臨床分期及淋巴結轉移是影響卵巢癌患者預后的危險因素，ZNF703的表達越高，其預后越差（P＜ 0.05），將三者納入多因素分析后發現臨床FIGO分期是患者預后的獨立危險因素。這些結果表明ZNF703表達水平在卵巢癌組織中表達上調且與不良預后相關。見表3。

表3 卵巢漿液性癌不同臨床病理參數的單因素和多因素Cox分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox analyses of different clinicopathological parameters in ovarian serous cancer

圖2 ZNF703免疫組化統計及數據庫結果Fig.2 Immunohistochemistry statistical analyses and database results for ZNF703

3 討論

卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，發現時往往處于晚期，患者生存時間短、預后差。轉錄因子在基因表達調控中起到核心作用，主要表現在通過影響轉錄復合物的形成及活性來控制染色質的基因轉錄和空間結構，進而調節如細胞分化、發育、細胞代謝、細胞凋亡與自噬、血管生成及干性維持等許多生物學過程，在基因表達調控中起著核心作用，其發揮作用的主要機制是通過鋅指結構與基因中啟動子或增強子的特異性結合域序列進行結合，并形成轉錄復合物激活或抑制轉錄［9］。

ZNF703是一種轉錄因子，屬于NET/NlZ家族成員，定位于8p11.23，主要分布于細胞核。ZNF703及其同系物有6個進化保守域，這些特定結構域對于 NET/NlZ蛋白正確的亞細胞分布和轉錄抑制作用是必需的。ZNF703在早期中胚層與神經嵴和基板發育中具有不同且可分離的功能。其作為轉錄因子Pax3和Zic1的靶標，促進非洲爪蟾神經嵴的形成。SIRCOLOMB等［10］發現ZNF703抑制轉化生長因子-β受體的活性及E鈣黏蛋白的表達，從而促進細胞的增殖及遷移，減少細胞間黏附。在結直腸癌中，體外細胞研究［11］表明ZNF703促進腫瘤細胞侵襲。ZNF703在胃癌浸潤組織中高表達并與浸潤深度和淋巴結轉移相關。在甲狀腺癌中的研究也得到了相同的結論。

ZNF703對腫瘤的惡性進展發揮著重要且機制多樣化的作用。1項關于乳腺癌的研究［12］揭示了上游分子lncRNA SPRY4-IT1通過調節ZNF703促進乳腺癌細胞增殖。不僅如此，同樣的機制也在食管鱗狀細胞癌中得到驗證。另一方面，在肺腺癌中發現了ZNF703的上游調節通路。同樣的，在胃癌中，miR-491-5p調節ZNF703，LBX2-AS1被認為上游調節分子。在頭頸部鱗狀細胞癌中，ZNF703過度表達可能與PI3K/AKT通路的激活或者拷貝數變異有關［13-14］。同樣的，在甲狀腺髓樣癌中ZNF703通過AKT/mTOR通路促進癌細胞在體內外的增殖［15］。ZNF703可以通過激活AKT-mTOR通路參與非小細胞肺癌的發生發展過程［7］。

也有體內外研究［16］發現ZNF703可以通過PI3K/AKT/GSK-3信號通路促進口腔鱗狀癌細胞的生長和轉移。已有研究［17］證明卵巢癌組織中ZNF703mRNA高表達，但是研究樣本僅限于正常卵巢組織及卵巢癌組織，且沒有蛋白水平的驗證。本研究應用臨床標本發現ZNF703蛋白在卵巢漿液性癌組織中過表達，表達水平明顯高于交界組、良性組及正常組，并且ZNF703高表達的患者生存時間明顯縮短。

本研究結果顯示，ZNF703是卵巢癌的預后因素，但并非獨立，可能受到很多其他臨床因素共同影響，說明ZNF703可以作為臨床標志物，與其他標志物一起用于卵巢癌的診斷、治療及監測。