杞參方對高滲誘導的干眼模型角膜上皮細胞保護機制的研究

趙磊，楊笑薇，左韜，姜艷華，周慧敏

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院眼科，沈陽 110034；3.沈陽市第四人民醫院眼科，沈陽 110031）

干眼是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩定或眼表微環境失衡的慢性眼表疾病，可伴有眼表炎癥反應、組織及神經異常，造成眼部不適癥狀和（或）視功能障礙［1］。淚膜不穩定與眼表上皮細胞損傷互為因果，可形成惡性循環加重病情［2］。干眼的研究一直是眼科專業領域的焦點，中醫藥在干眼治療方面具有獨特優勢［3］。左韜等［4］的研究顯示，杞參方能有效改善干眼患者的眼部癥狀、淚液分泌量和淚膜破裂時間，但其機制尚未明確。本研究基于細胞外調節蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated proein kinase，p38MAPK）通路研究杞參方對500 mOsm/L滲透壓誘導的人角膜上皮細胞（human corneal epithelial cells，HCECs）干眼模型的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人12-SV40角膜上皮細胞株（CRL-11135 HCECs）購自美國標準生物品收藏中心。杞參方（熟地黃 20 g、山藥 9 g、山茱萸 9 g、牡丹皮 9 g、澤瀉 6 g、茯苓 6 g、枸杞子 6 g、菊花 6 g、人參 3 g、麥冬 9 g、五味子 6 g、通草 6 g、黃精 9 g、葛根 9 g）由北京康仁堂藥業有限公司提供。CCK-8試劑盒購自北京Solarbio 公司，白細胞介素-1β（interlukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（SEA563Mu）購自武漢優爾生商貿有限公司；IL-8酶聯免疫檢測試劑盒（F10850）購自上海西唐生物科技有限公司；Anti-caspase-3抗體、Anti-ERK1（phospho Y204）抗體（ab131438）、Anti-p38抗體（ab170099）、Anti-p38（phospho T180）抗體（ab178867），購自英國Abcam公 司；ERK1抗 體（G-8）sc-271269購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制備：取SPF級成年雄性Wistar大鼠40只，體質量220～240 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號SCXK遼2020-0001，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室［許可證編號：SYYK（遼）2019-0004］。適應性喂養大鼠2 d、禁食12 h后，空白血清組大鼠（10只）予蒸餾水灌胃，杞參方高、中、低含藥血清組大鼠（每組10只）分別予高、中、低劑量杞參方顆粒蒸餾水沖服灌胃，2次/d，連續3 d。參考《藥理實驗方法學》折算，大鼠劑量按照成人日劑量的6.36倍分沖備用，成人用量為1.88 g·kg-1·d-1，折算后大鼠最終等效劑量為11.98 g·kg-1·d-1，則杞參方高、中、低劑量分別為23.96、11.98、5.99 g·kg-1·d-1。末次灌胃1 h后采血。室溫靜置離心以分離血清，56 ℃水浴滅活40 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20 ℃保存備用。本研究通過遼寧中醫藥大學實驗動物中心倫理委員會審核并認真執行（倫理批號 210000420200010）。

1.2.2 高滲透壓干眼HCECs造模：在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養基中加入無菌500 mOsm/L滲透壓的飽和氯化鈉溶液，培養基pH（7.2±0.2），培養HCECs。

1.2.3 細胞分組與給藥：（1）BC組，正常條件培養的HCECs；（2）HO組，干眼模型細胞加入15%空白血清15 μL；（3）HO+SH組，干眼模型細胞加入0.3%玻璃酸鈉滴眼液15 μL；（4）HO+HD組，干眼模型細胞加入15%杞參方高劑量含藥血清15 μL；（5）HO+MD組，干眼模型細胞加入15%杞參方中劑量含藥血清15 μL；（6）HO+LD組，干眼模型細胞加入15%杞參方低劑量含藥血清15 μL。

1.2.4 CCK-8法檢測各組HCECs存活率：將HCECs接種于96孔板（1×104/mL，100 μL/孔），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h；棄培養基，分別加入100 μL 滲透壓為500 mOsm/L的含空白血清、玻璃酸鈉、不同濃度杞參方含藥血清的培養基，每組設3個復孔，繼續培養24 h；棄舊培養基，加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h，檢測450 nm吸光度值（A）。計算細胞存活率=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

1.2.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-8的表達：按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 免疫細胞化學（immunocytochemistry，ICC）法檢測凋亡因子caspase-3的表達：制作細胞片后進行染色。PBS清洗3次，H2O2室溫孵育10 min去除內源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉10～15 min，caspase-3抗體4℃孵育過夜，PBS清洗，滴加生物素標記的抗鼠/兔IgG室溫反應20 min，PBS清洗，滴加HRP標記的鏈霉親和素室溫反應20 min，DAB顯色，蘇木素復染。鏡下觀察并采集照片，測定5個隨機視野的平均A值，作為該樣本中目的蛋白表達水平。

1.2.7 Western blotting檢 測ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達：將HCECs以3×105/孔的密度接種于12孔細胞培養板，培養18～24 h至鋪滿培養板85%左右，棄去舊培養基，分別給予正常等滲培養基和滲透壓為500 mOsm/L的含空白血清、0.3%玻璃酸鈉滴眼液、不同濃度杞參方顆粒含藥血清的培養基，培養4 h后，收集細胞備用。相同實驗重復3次。提取各組細胞總蛋白質，BCA法測定蛋白質的濃度。蛋白配平變性后行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流模式電流轉膜1 h。室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液（1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜。加入山羊抗兔HRP標記的二抗（1∶5 000稀釋）中，搖床室溫孵育2 h。TBST洗膜，ECL發光，Imaging System化學發光成像分析儀成像。通過Quantity-one分析軟件對蛋白條帶進行OD定量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以表示。多組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HCECs存活率比較

各組HCECs存活率[BC組（1.083±0.069 5）%，HO組（0.379±0.044 6）%，HO+SH組（0.601±0.046 8）%，HO+HD組（0.968±0.133 1）%，HO+MD組（0.676±0.098 7）%，HO+LD組（0.642±0.084 3）%]比較，差異有統計學意義（F=91.221，P＜ 0.01）。與BC組相比，各組HCECs存活率均顯著減少（P＜ 0.01）；與HO組相比，各用藥組HCECs存活率均顯著增加（P＜ 0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD組HCECs存活率顯著增加（P＜ 0.01）。

2.2 各組細胞外液IL-1β、IL-8表達水平比較

ELISA結果顯示，與BC組相比，各組細胞外液炎性細胞因子IL-1β、IL-8表達水平均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，各用藥組的IL-1β、IL-8表達水平均減少（P＜ 0.05、0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD、HO+MD組IL-1β與HO+HD、HO+LD組IL-8表達水平均顯著減少（P＜ 0.01）。見表1。

表1 各組細胞外液IL-1β和IL-8表達水平比較（ng/L）Tab.1 Comparison of the expression levels of inflammatory factors IL-1β and IL-8 in extracellular fluid（ng/L）

2.3 各組細胞凋亡因子caspase-3表達水平比較

ICC結果顯示，各組HCECs凋亡因子caspase-3表達水平［HO組0.256±0.029，HO+SH組0.222±0.034，HO+HD組0.188±0.027，HO+MD組0.192±0.019，HO+LD組0.227±0.027］比較，差異有統計學意義（F=23.588，P＜ 0.01）。與BC組相比，各組HCECs中caspase-3蛋白表達水平均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，HO+SH、HO+HD、HO+MD組caspase-3表達水平均減少（P＜ 0.05、0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD組caspase-3蛋白表達水平減少（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 各組HCECs中凋亡因子caspase-3表達 HE×200Fig.1 Comparison of expression of apoptosis factor caspase-3 in HCECs HE ×200

2.4 各 組HCECs中ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平比較

Western blotting結果顯示，各組HCECs中ERK1、p38MAPK蛋白表達水平組間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。而各組HCECs的p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達水平組間比較，差異有統計學意義；與BC組相比，各組HCECs中的p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，HO+SH、HO+HD、HO+MD組的p-ERK1與HO+HD、HO+MD組的p-p38MAPK蛋白表達均減少（P＜ 0.05、＜0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD、HO+MD組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達水平減少（P＜ 0.05，0.01）。見表2、圖2。

圖2 各組HCECs的ERK1、p38MAPK、p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達Fig.2 Expression of ERK1，p38MAPK，p-ERK1，and p-p38MAPK proteins in HCECs of each groups

表2 各組HCECs中ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK表達結果比較Tab.2 Comparison of expression levels of ERK1，p-ERK1，p38MAPK and p-p38MAPK in HCECs of each group

3 討論

杞參方由杞菊地黃丸合生脈飲再加通草、黃精、葛根組合而成。杞菊地黃丸滋補肝腎之陰，為滋陰潤目名方。相關meta分析顯示，杞菊地黃丸聯合西藥治療干眼的療效優于單純應用西藥組［5-6］。杞菊地黃丸還可降低淚液中IL-1β、IL-8、MMP-9的表達水平［7］。生脈飲具有補益肺腎之氣、養陰生津之效，具有抑制炎癥反應的作用［8］。加葛根、黃精、通草以補氣養陰，健脾益腎，通利三焦。前期研究［9］證實，杞參方可降低炎性細胞因子表達水平，減少大鼠干眼模型角膜上皮損傷及淚腺細胞凋亡。

淚膜和眼表協會國際干眼工作小組第2次報告（Tear Film and Ocular Surface Society Dry Eye Workshop，TFOSDEWS Ⅱ）得出結論：干眼的核心機制是蒸發誘導的淚液高滲直接損害眼表，引起炎癥反應，最常見為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated proein kinase，MAPK）與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）介導［10］。MAPK主要負責從細胞表面到核內部的信號傳遞，調控炎癥、細胞凋亡、腫瘤細胞侵襲等生理活動［11］。ERK1、p38MAPK為MAPK的亞族。研究［12-14］證實，炎性細胞因子在干眼發病過程中表達明顯增強，而其表達及釋放與ERK1、p38MAPK通路的激活密切相關，通過干預ERK1、p38MAPK表達可抑制干眼的炎癥信號向細胞凋亡通路轉導。本研究結果顯示，各組HECEs中ERK1、p38MAPK蛋白表達水平比較，差異無統計學意義。在未受刺激的細胞內，MAPK在細胞質內處于靜止狀態，當細胞受到刺激后，MAPK被激活而發生逐級磷酸化，磷酸化后的MAPK蛋白則會進入細胞核內，故而出現各組HCECs中ERK1、p38MAPK蛋白表達水平組間比較無統計學差異，而各組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達水平組間比較有統計學差異。這與郭宣妮等［15］的研究結果基本一致。郭宣妮等［15］發現干眼組患者淚液中p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達與淚膜破裂時間和基礎淚液分泌試驗均呈顯著負相關，與角膜熒光素染色評分呈顯著正相關，與本研究的HO組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達增高的結果一致。本研究發現，杞參方高、中劑量組可減少干眼模型HCECs內p-ERK1、p-p38MAPK蛋白的表達，提示高、中劑量杞參方可能對干眼模型HCECs具有抗炎及抗細胞凋亡的作用。ERK1、p38MAPK通路可促進干眼模型角結膜上皮IL-1、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子的釋放及細胞凋亡［16-17］。本研究中，加入空白血清的HO組干眼模型細胞 IL-1β、IL-8、caspase-3表達均增高，而高、中劑量杞參方血清組細胞IL-1β、IL-8與caspase-3則明顯低于HO組。提示杞參方可能通過降低ERK1、p38MAPK的磷酸化來減少IL-1β、IL-8與caspase-3的表達治療干眼。

綜上，杞參方可降低高滲誘導HCECs的ERK1、p38MAPK的磷酸化蛋白表達，降低細胞外液炎性細胞因子IL-1β、IL-8和細胞凋亡因子caspase-3的表達，最終有效抑制炎癥反應和細胞凋亡。