microRNA-328與心房顫動(dòng)患者心房重構(gòu)的相關(guān)性

劉兆奕，吳桂平，林瑤瑤，趙紅麗，張曉丹

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽(yáng) 110002；2.研究生院，沈陽(yáng) 110002）

心房顫動(dòng)（簡(jiǎn)稱房顫）是一種不規(guī)則的心律，即規(guī)則有序的心房活動(dòng)喪失，代之以快速無(wú)序的顫動(dòng)波，是臨床上最常見的快速型房性心律失常之一。其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)不斷上升，在60～74歲人群中發(fā)病率高達(dá)8.0%［1］，在全球每年影響約3 300多萬(wàn)患者。房顫引起的血流動(dòng)力學(xué)異常和血栓事件（如心力衰竭、腦卒中等），使患者的致殘率、死亡率明顯增加。現(xiàn)今，房顫的治療仍有很大的局限性，根本原因是其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前存在多種假說(shuō)，包括多小波假說(shuō)、局灶性沖動(dòng)假說(shuō)、心房重構(gòu)假說(shuō)和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制假說(shuō)等。心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的基礎(chǔ)，心房重構(gòu)主要包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和自主神經(jīng)系統(tǒng)重構(gòu)。結(jié)構(gòu)重構(gòu)的特點(diǎn)是心房纖維化、心房擴(kuò)大以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，是房顫的中心環(huán)節(jié)，與其相關(guān)的分子機(jī)制較多，關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。因此，進(jìn)一步研究心房重構(gòu)的機(jī)制能夠?yàn)榉款澋姆乐翁峁┲匾睦碚撘罁?jù)，便于早期對(duì)房顫進(jìn)行安全、有效的干預(yù)和治療。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，以mRNA為靶分子，與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合，通過(guò)切割降解mRNA或者抑制轉(zhuǎn)錄后的靶基因、改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)的多種生物學(xué)功能。ZHAO等［2］通過(guò)組織學(xué)檢查，證明轉(zhuǎn)基因小鼠中miRNA-328以旁分泌方式將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)心肌纖維化，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)。近年來(lái)，miRNA在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。已有研究［3］表明，miRNA-328在犬房顫模型中明顯上調(diào)。但miRNA-328水平的升高與心房重構(gòu)是否相關(guān)，以及miRNA-328對(duì)房顫的發(fā)生和維持是否發(fā)揮作用，未見研究報(bào)道。本研究首次探討了miRNA-328在房顫患者血清中的表達(dá)水平及其與心房重構(gòu)的相關(guān)性，從而為房顫患者心房重構(gòu)的診療和干預(yù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)《2016年歐洲心臟病學(xué)會(huì)房顫管理指南》，選取2019年1月10日至2020年5月31日于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的房顫患者120例（房顫組），并選擇同期正常體檢者40例作為對(duì)照組。房顫組分為陣發(fā)性房顫（40例）、持續(xù)性房顫（48例）和永久性房顫（32例）3個(gè)亞組。采用美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)120例房顫患者進(jìn)行心功能分級(jí)，其中Ⅰ級(jí) 13例，Ⅱ級(jí) 40例，Ⅲ級(jí) 36例，Ⅳ級(jí) 31例。所有患者行一般病史采集、心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖、心臟超聲檢查、血糖、血脂、miRNA-328定量檢測(cè)。所有研究對(duì)象均自愿參加本研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：房顫病史不明，近期感染及電解質(zhì)紊亂，先天性心臟病，惡性腫瘤，帕金森病，精神病不配合治療，嚴(yán)重肝腎功能障礙，結(jié)締組織病，自身免疫性疾病，哺乳和妊娠期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集：入院后首日或次日空腹12 h以上采集肘靜脈血，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、N端腦利鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）、肝腎功能等，并留取空腹血，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明離心取血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2.2 心臟彩色多普勒超聲檢查：記錄左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心房?jī)?nèi)徑（left atrial diameter，LAD）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-328相對(duì)表達(dá)量：利用血液總RNA提取試劑盒（DP443，天根生化科技有限公司）提取總RNA，具體參照說(shuō)明書進(jìn)行，采用微升核酸分析（Nanodrop 2000c，美國(guó)Thermo Scientific公司）檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PCR-311F，日本TOYOBO公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBRTMGreen試劑盒（QPK-201，美國(guó)ABI公司）分別檢測(cè)樣本中miRNA-328-5p和U6的表達(dá)水平。每個(gè)樣本至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-328-5p在各組中的相對(duì)表達(dá)量。miRNA-328-5p和U6引物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司 提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較

房顫組和對(duì)照組在年齡、性別、吸煙、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；房顫組中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和高血壓的患者比例及LAD均高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。3個(gè)房顫亞組比較，年齡、LAD、LVEF、NT-proBNP的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1、2。

表1 房顫組和對(duì)照組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data between the atrial fibrillation and control groups

表2 房顫亞組一般資料的比較Tab.2 Comparison of general data among atrial fibrillation subgroups

2.2 miRNA-328相對(duì)表達(dá)量

對(duì)照組和房顫組miRNA-328的表達(dá)水平分別為1.25±0.11和1.66±0.17，房顫組miRNA-328的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫亞組miRNA-328的表達(dá)水平分別為1.54±0.09、1.61±0.05和1.84±0.14，永久性房顫亞組miRNA-328表達(dá)水平最高，與陣發(fā)性、持續(xù)性房顫亞組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），持續(xù)性房顫亞組miRNA-328表達(dá)水平較陣發(fā)性房顫亞組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)心功能患者miRNA-328的表達(dá)水平分別為1.26±0.13、1.55±0.16、1.78±0.46和2.06±0.75，隨著心功能分級(jí)的增加，miRNA-328表達(dá)水平也逐漸升高，不同心功能分級(jí)間miRNA-328表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.3 Pearson相關(guān)性分析及偏相關(guān)分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，房顫組中，miRNA-328與LAD、年齡呈正相關(guān)（r=0.264，P＜ 0.05；r=0.611，P＜ 0.05）。偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、性別、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓、吸煙等因素后，房顫組中miRNA-328表達(dá)水平仍與LAD呈正相關(guān)（r=0.368，P＜ 0.05），提示miRNA-38參與心房重構(gòu)過(guò)程。

2.4 ROC曲線分析miRNA-328的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清miRNA-328的曲線下面積為0.782，95%置信區(qū)間為0.689～0.875（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 miRNA-328相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis of miRNA-328 relative expression level

3 討論

目前，房顫的治療方式主要包括射頻消融術(shù)、抗凝、轉(zhuǎn)復(fù)竇性心律、控制心室率等藥物治療以及外科的改良迷宮手術(shù)治療，但這些治療都存在復(fù)發(fā)率高、有效性低等局限性，其根本原因是房顫的發(fā)生機(jī)制尚未明確。目前認(rèn)為心房重構(gòu)是房顫的主要發(fā)病機(jī)制，因此針對(duì)心房重構(gòu)的房顫上游治療成為研究的熱點(diǎn)。

研究［4］表明，心房重構(gòu)主要是細(xì)胞外基質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，間質(zhì)中膠原蛋白和纖維蛋白合成增加導(dǎo)致心肌纖維化、心肌順應(yīng)性下降以及心房擴(kuò)大等一系列病理生理改變。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖分化，從而影響心房重構(gòu)。已有研究［5-7］表明，miRNA-26、miRNA-328、miRNA-1、miRNA-133、miRNA-590、miRNA-21、miRNA-29等都與心房重構(gòu)有關(guān)。這也提示，有眾多miRNA參與調(diào)節(jié)心肌纖維化過(guò)程，分別影響房顫的發(fā)生和維持。SOEKI等［7］的研究提示，miRNA-328在左心房重構(gòu)中的重要性大于miRNA-1。

miRNA-328是一種位于染色體16q22.1上的小分子RNA，已有研究［8-10］顯示，miRNA-328不僅在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，還參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、腫瘤生長(zhǎng)、炎癥等一系列生物學(xué)過(guò)程，因此可作為多種疾病診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。MCMANUS等［11］發(fā)現(xiàn)，miRNA-328通過(guò) 影響L型Ca2+通道密度促進(jìn)心房電重構(gòu)，認(rèn)為miRNA-328可作為進(jìn)一步探索房顫的重要標(biāo)志物。LI等［12］采用RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)房顫兔右心房進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-328通過(guò)調(diào)節(jié)下游蛋白編碼基因CACNA1C參與心房電重構(gòu)。LU等［13］在房顫犬模型心房組織中證明了miRNA-328通過(guò)影響L型Ca2+通道基因，使動(dòng)作電位時(shí)程縮短，從而誘導(dǎo)房顫的發(fā)生，下調(diào)miRNA-328表達(dá)水平或基因敲除miRNA-328可抑制房顫。既往研究［14］顯示，LAD是發(fā)生房顫的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但房顫患者中miRNA-328水平與LAD的相關(guān)性少有文獻(xiàn)報(bào)道。另外，動(dòng)物模型中的房顫與臨床患者房顫情況存在差異。

本研究以臨床房顫患者為研究對(duì)象，檢測(cè)其血清miRNA-328水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，房顫患者miRNA-328的表達(dá)水平明顯升高。且在調(diào)整性別、年齡、高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、吸煙等因素后，房顫組中血清miRNA-328表達(dá)水平仍與LAD呈正相關(guān)，提示miRNA-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過(guò)程。永久性房顫亞組中miRNA-328表達(dá)水平顯著高于陣發(fā)性房顫亞組和持續(xù)性房顫亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。持續(xù)性房顫組中miRNA-328表達(dá)水平較陣發(fā)性房顫組高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），提示房顫持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，血清miRNA-328的表達(dá)水平越高，但在陣發(fā)性房顫和持續(xù)性房顫患者中差異不大。這與王璽等［15］的研究結(jié)果不同，考慮可能與樣本量差異以及研究的房顫人群之間的異質(zhì)性有關(guān)。同時(shí)，ROC曲線分析提示，miRNA-328對(duì)房顫的發(fā)生具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究提示，miRNA-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過(guò)程，可成為房顫早期預(yù)警的生物學(xué)標(biāo)志物和未來(lái)治療房顫的新靶點(diǎn)。

此外，房顫是心功能不全患者最常合并的心律失常，兩者常同時(shí)存在，相互促進(jìn)，互為因果。且心功能不全患者本身具有心律失常易感性，心功能不全的程度越重，發(fā)生心律失常的傾向性越大。本研究中，隨著心功能分級(jí)的增加，房顫患者血清miRNA-328表達(dá)水平逐漸升高，提示在臨床上心功能不全患者發(fā)生房顫的可能性大，miRNA-328有望作為預(yù)測(cè)心功能不全患者病情嚴(yán)重程度和心功能狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。但本研究樣本量少，缺乏多中心的研究，結(jié)果可能存在一定偏倚，對(duì)于心功能不全合并房顫患者的心功能分級(jí)是否與miRNA-328表達(dá)水平有直接關(guān)系，還需進(jìn)行進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究。