基于網絡藥理學探究黃芪-黨參藥對治療糖尿病腎病的作用機制

劉正平 曹 釙 鐘 劍 魏 宇 王世東 史月欣

1.北京中醫藥大學第一臨床醫學院，北京 100700；2.北京中醫藥大學東直門醫院腎病科，北京 100700

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一。研究顯示，2019 年全球約4.63 億成人患糖尿病，預計到2045 年將達到7 億[1]。隨著糖尿病患病率的增加，DN 患病人數也在逐年上升，并且DN 已經成為終末期腎病的主要原因[2]。但目前西醫尚無阻止DN 進展的特效治療方法。針對這一現狀，中醫藥領域進行了大量的探索性研究，證實中醫藥可以通過改善腎循環、減少尿蛋白來延緩DN 進展[3]。中醫學中一般將DN 歸為“消癉”“腎消”“水腫”等范疇[3]。DN 的病機為虛、瘀、濁，而虛為發病的基本條件。虛證又以氣虛為核心，并見陽氣、氣血、氣陰的虧虛，故治療補虛以補氣為首要任務[4]。黃芪-黨參是臨床上常用的補氣藥對，黨參偏于陰而補中氣，黃芪偏于陽而實衛表之氣，二藥相和，一表一里，一陰一陽，相輔相成，共奏補氣扶正之效[5]。臨床研究證實黃芪-黨參藥對配伍的復方治療DN 能明顯降低尿蛋白，具有很好的保護腎功能的作用[6]，但其治療DN 的作用機制尚不明確。本研究通過網絡藥理學方法探索該藥對治療DN 的作用機制，為后續臨床治療及實驗研究提供理論基礎和研究思路。

1 資料與方法

1.1 黃芪-黨參有效成分及作用靶點的收集

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺檢索黃芪、黨參的化學成分，根據藥代動力學參數，將口服生物利用度≥30%及類藥性≥0.18 作為篩選條件，獲取黃芪、黨參藥物有效成分，并收集相應的作用靶點。通過Uniprot 數據庫將作用靶點轉化為基因靶點。

1.2 藥物有效成分-靶點網絡構建

將基因靶點和有效成分導入Cytoscape 3.8.1 軟件，構建藥物有效成分-靶點的網絡圖。

1.3 DN 相關靶點的收集

通過檢索詞“diabeticnephropathy”，分別檢索OMIM、DisGeNET、GeneCards 數據庫收集相關靶點，合并去重后得到DN 的疾病靶點數據庫。

1.4 蛋白-蛋白互作網絡的構建

將基因靶點和疾病靶點導入Venny 2.1 平臺，取交集后將其上傳至STRING 11.0 數據庫，構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路富集分析

將交集靶點上傳至Metascape 數據庫，進行GO及KEGG 通路富集分析。

2 結果

2.1 有效成分及作用靶點的收集

經過檢索和篩選后共得到黃芪-黨參藥對有效成分34 個（表1），獲得基因靶點221 個。

表1 黃芪-黨參藥對有效成分信息

2.2 藥物有效成分-靶點網絡圖

利用Cytoscape 3.8.1 軟件，構建了有257 個節點、638 條邊的藥物成分-靶點網絡圖，見圖1。節點的度值越大，提示其在網絡中的地位越重要。由此篩選出黃芪-黨參重要有效成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素等。

圖1 黃芪、黨參有效成分-靶點圖

2.3 PPI 網絡構建

經檢索和篩選獲得1466 個疾病靶點，與基因靶點取交集獲得100 個交集靶點。將其上傳至STRING 11.0 平臺構建PPI 網絡，見圖2。采用Cytoscape 軟件計算PPI 網絡節點的度值，取前15 個作為核心靶點，按度值大小排序依次為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53、CASP3、MAPK1、JUN、MMP9、MAPK8、PTGS2、EGF、CCL2、CXCL8、EGFR。

圖2 疾病-藥物的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.4 GO 及KEGG 分析結果

GO 分析結果顯示：交集靶點涉及的生物過程有凋亡信號通路、活性氧代謝過程、細胞對生長因子刺激等；根據P 值大小取前20 作圖，見圖3。KEGG 分析結果顯示：交集靶點涉及的通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT等信號通路。借助imageGP 在線作圖工具，根據P 值大小取前20 繪制氣泡圖，見圖4（封三）。

圖3 黃芪-黨參藥對作用于糖尿病腎病靶點的基因本體分析

圖4 黃芪-黨參藥對作用于糖尿病腎病靶點的京都基因和基因組數據庫分析（見內文第122 頁）

3 討論

DN 早期病理主要表現為腎小球濾過率增加、腎小球系膜區增寬和腎小球毛細血管基膜增厚，后期表現為腎小球濾過率下降，腎小球、腎小管間質纖維化[7]。而DN 的發病機制極其復雜，目前認為與遺傳因素、代謝機制紊亂、血流動力學改變、炎癥反應、氧化應激等相關[7-8]。

本研究篩選出黃芪-黨參藥對重要的有效成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素等。槲皮素、山柰酚、木犀草素均具有抗炎、抗氧化、保護腎臟的作用[9-11]。研究表明，槲皮素可以通過激活海馬通路抑制腎小球系膜細胞增殖[12]、拮抗轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1的活性來對抗腎小球基底膜增厚[13]，從而保護腎功能。山柰酚可以通過抑制RhoA/Rho 激活[14]、抑制TGF-β1誘導的大鼠腎小管細胞的上皮-間質轉化過程，改善腎損傷和纖維化。Zhang 等[15]認為木犀草素可以通過抑制STAT3 通路激活來抑制炎癥反應和氧化應激，從而減少腎纖維化，延緩DN 進展。

通過PPI網絡預測AKT1、IL-6、TNF等為治療DN 的核心靶點。AKT 可在人體組織中廣泛表達。石明雋等[16]研究發現，AKT 可能通過TGF-β1激活PI3K/AKT 信號通路，促使細胞增殖、分化，加重腎臟肥大和細胞外基質沉積，促進腎小管間質纖維化。IL-6、TNF是目前研究最廣泛的參與DN 炎癥機制的細胞因子[17-19]。IL-6 可以通過與系膜細胞受體結合刺激腎小球系膜增殖，改變腎小球系膜結構[20]；還能通過激活JAK2/STAT3 通路促使腎臟足突細胞肥大[21]，多途徑造成DN 的發生、發展。張國艷等[22]認為TNF-α 可以直接誘導腎臟細胞產生活性氧，導致腎小球血管壁的改變，從而增加白蛋白的通透性，產生蛋白尿。由PPI網絡結果顯示的核心靶點涉及炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡等方面，直接或間接作用于腎小球系膜細胞、足突細胞、細胞外基質及腎小管等部位，從而參與DN 的發生、發展。

在KEGG 分析結果中，黃芪-黨參藥對治療DN相關通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF 等信號通路。研究顯示，AGEs 與其受體RAGE結合后，可以通過增加細胞因子的釋放和細胞外基質的產生，進而導致腎小球肥大、硬化[23]。此外，AGERAGE 信號通路的激活引起細胞內多種通路的激活，如PI3K/AKT、p38MAPK、VEGF 等信號通路[24-25]。IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路均為重要的炎癥信號通路，能增加TNF-α、IL-6、TGF-β1 等促炎性細胞因子的產生，加重體內炎癥反應，從而加快DN 的發生及發展[26]。由此可以推測，黃芪-黨參藥對通過多條通路抑制腎臟細胞異常增殖、減輕體內免疫炎癥反應來治療DN。

本研究結果顯示，黃芪-黨參的主要有效成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素等，核心作用靶點以AKT1、IL-6、TNF、VEGFA 等為主，并通過調節AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT 等信號通路發揮治療DN 的作用。