茅臺和堯治河高溫大曲細菌群落結構差異及功能預測

侯強川,王玉榮,王文平,田龍新,趙慧君,郭壯*

1(湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創新中心,湖北 襄陽,441705) 3(湖北堯治河楚翁泉酒業有限公司,湖北 襄陽,441614)

白酒作為我國的國粹,擁有眾多的種類和品系,如清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒和兼香型白酒等[1],其中醬香型白酒釀造工藝最為復雜[2],導致不同企業生產的產品風味及品質存在較大差異。在醬香型白酒生產過程中,高溫大曲是其發酵重要的糖化酶和微生物來源[3],大曲質量在很大程度上決定著最終產品的品質。高溫大曲在制作時,由于不同曲塊在車間堆放發酵時所處的位置不同,各個曲塊發酵時的微環境如溫度、濕度、氧濃度等均存在一定差異,導致最終成品曲塊的顏色有所不同。具體而言,如果發酵前期溫度低,發酵后期干燥差,會生產出白色大曲；發酵前期溫度適宜,發酵后期干燥充分,會生產出黃色大曲；發酵前期升溫快,發酵后期干燥差,則會產生黑色曲塊(較為少見)[4]。已有的研究表明不同顏色的高溫大曲微生物群落結構及核心微生物類群等存在明顯差異[4]。

茅臺酒作為中國公認的高品質醬香型白酒,其風味濃郁醇厚、回味綿長,幾乎代表了醬香型白酒制作的最高工藝。GAN等[5]研究發現,放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是茅臺高溫大曲中的優勢細菌門,同時不同顏色高溫大曲菌群群落結構存在較大差異。以茅臺醬香型高溫大曲為標尺,在對中小型醬香型白酒企業高溫大曲細菌類群進行測序的基礎上,采用生物信息學和多元統計學手段對兩者菌群群落結構和功能差異進行甄別,并以此為靶點在后續大曲制作過程中進行工藝改良對于中小型醬香型白酒生產企業產品品質的提升具有重要意義。

鑒于此,本研究將國際數據庫中湖北省堯治河楚翁泉酒業有限公司(下簡稱堯治河)[6]和茅臺高溫大曲群落結構的細菌測序數據[5]進行了下載和歸并分析,從菌群群落結構、功能以及細菌表型等多個維度全面探究了兩者的共性和差異,通過本研究的開展以期為襄陽乃至湖北地區高溫大曲制作工藝的改良提供理論依據和有益指導。

1 材料與方法

1.1 測序數據的獲取

按照GAN等[5]的描述,本研究從CNGB國家基因庫(https://db.cngb.org/cnsa/,編號:CNP0000-316)下載了茅臺白色高溫大曲(白曲)和黃色高溫大曲(黃曲)測序數據各26份,同時整合了本研究團隊前期采集自湖北省堯治河楚翁泉酒業有限公司的白曲和黃曲測序數據各10份(https://www.mg-rast.org/,編號∶mgp96594)[6],共計72份測序數據。

1.2 生物信息學分析

使用QIIME(V1.9.1)平臺對測序數據進行細菌群落結構和多樣性的分析,具體生物學分析過程包括：1)采用PyNAST軟件對測序數據進行比對和校準[7]；2)使用QIIME中的pick_closed_reference_otus.py命令結合Greengene數據庫在97%的相似度對校準后的序列進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分和注釋[8-9]；3)使用vsearch軟件對屬于嵌合體的OTU進行識別并去除[10]；4)通過統計各OTU包含的序列數及對應的注釋信息計算各樣本中細菌在門和屬水平的相對含量；5)基于各樣品在屬水平的相對含量分別基于Bray-Curtis距離和Binary Jaccard距離進行β多樣性分析；6)通過計算樣本相同測序深度下的α多樣性指數(Chao1指數、Shannon指數、Observed species指數和Simpson指數)評估樣品中菌群的豐度和多樣性,具體操作為以測序量最低的樣品為基準,各樣品隨機抽取相同的序列數,并計算上述4個α多樣性指標,重復該過程1 000次,取各指標1 000次計算得到的平均值作為該樣品最終的α多樣性指數值；7)應用生物信息學開源軟件PICRUSt對大曲菌群的功能進行預測[11],得到各樣品直系同源基因簇(clusters of orthologous groups,COG)組成；8)使用BugBase工具(https://bugbase.cs.umn.edu/)對各酒曲樣品細菌表型進行分類統計和可視化。

1.3 多元統計學分析

使用非參數的Mann-Whitney秩和檢驗對兩組樣品進行差異顯著性檢驗,使用Benjaminiand Hochberg的方法校正多次檢驗的假陽性率[12]。使用置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)檢驗影響酒曲中菌群組成的關鍵因素。使用Spearman Rank 相關性分析確定茅臺和堯治河酒曲中菌群彼此間的相關關系性。所有分析在R語言(V3.2.5)和STAMP(V2.1.3)軟件中實現。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲中細菌菌群結構的整體組成

在高溫大曲中共鑒定到23個細菌門和347個細菌屬,其中優勢細菌門(平均相對含量 >1%)主要包括厚壁菌門(82.32%)、放線菌門(7.72%)和變形菌門(5.80%)(圖1-a)；優勢細菌屬(平均相對含量 >1%)共有11個,主要包括芽胞桿菌屬(Bacillus,23.12%)、嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces,19.55%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus,6.43%)、Kroppenstedtia(5.51%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,4.41%)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora,4.26%)等。此外,各樣品平均約24.12%的菌群無法鑒定到屬水平。

a-門水平；b-屬水平圖1 不同地區和顏色高溫大曲在門和屬水平的菌群組成Fig.1 Bacterial composition of high-temperature Daqu in different regions and colors at phylum and genus level

2.2 高溫大曲核心菌群分析

本研究將在不同地區和不同顏色高溫大曲中均出現的OTU定義為高溫大曲的“核心OTU”,結果顯示共有180個OTU滿足該條件(圖2)。這些OTU主要注釋結果為嗜熱放線菌屬(45個)、芽胞桿菌屬(34個)、Kroppenstedtia(12個)、乳桿菌屬(9個)和葡萄球菌屬(9個)等。“核心OTU”注釋結果與酒曲中優勢菌屬的分析結果一致。值得注意的是,核心OTU中平均分別包含有堯治河大曲75.52%(22.33%～97.55%)的序列,而平均僅包含有茅臺大曲中3.60%(0.38%～7.53%)的序列。同時,來自同一地區不同顏色的高溫大曲亦擁有大量共有OTU,如在茅臺和堯治河不同顏色高溫大曲分別共有1 726和1 484個OTU。其中茅臺黃曲和白曲共有OTU主要注釋結果為芽孢桿菌屬(8.86%)、嗜熱放線菌屬(4.52%)、乳桿菌屬(4.40%)和Kroppenstedtia(2.14%)等。堯治河黃曲和白曲共有OTU主要注釋結果為嗜熱放線菌屬(29.99%)、糖多孢菌屬(10.85%)、芽孢桿菌屬(4.18%)和Kroppenstedtia(4.11%)等。

圖2 不同地區和顏色高溫大曲共有OTU分析Fig.2 OTUs shared by high-temperature Daqu in different regions and colors

此外,茅臺和堯治河不同顏色大曲共有OTU中分別有58.40%和34.30%無法鑒定到屬水平。上述結果顯示2個地區不同顏色高溫大曲共有菌群存在較大差異,同時茅臺大曲中存在較大比例的獨有菌群,對于大曲中在屬水平未能得到有效注釋的菌群需要后續研究進一步挖掘和解析。

2.3 不同地區和顏色高溫大曲菌群α多樣性分析

α多樣性指標可以反映不同樣品中菌群的豐度和多樣性差異。本研究分別使用Chao1指數、發現的OTU數及Shannon指數、Simpson指數表征高溫大曲中菌群的豐度和多樣性信息,結果如圖3所示。各個指標的結果均顯示堯治河高溫大曲菌群的豐度和多樣性顯著低于茅臺高溫大曲(P<0.05)。同時,與黃曲相比,白曲中菌群的豐度和多樣性會更高,但同一地區兩種顏色大曲菌群α多樣性差異不顯著(P>0.05)。

a-Chao1指數；b-發現的OTU數；c-Shannon指數；d-Simpson指數圖3 不同地區和顏色高溫大曲菌群α多樣性分析Fig.3 α-Diversity analysis of high-temperature Daqu in different regions and colors

2.4 不同地區和顏色高溫大曲菌群β多樣性分析

為了直觀的展現不同地區和不同顏色高溫大曲菌群群落結構異同,本研究分別基于Binary Jaccard距離和Bray-Curtis距離進行了主坐標分析,結果如圖4所示。基于Binary Jaccard距離的主坐標分析結果顯示(圖4-a),2個地區的樣品間存在明顯的分離趨勢,而同一地區不同顏色的大曲樣品間則存在明顯的重疊。基于Bray-Curtis距離的主坐標分析結果顯示(圖4-b),茅臺白曲與堯治河高溫大曲間存在明顯分離趨勢,而茅臺黃曲與堯治河高溫大曲存在一定重疊現象。此外,基于上述兩種距離的置換多元方差分析結果均表明,上述4組樣品菌群群落結構差異具有顯著性(P=0.001),并且地區對酒曲菌群的影響大于曲塊顏色。

a-Binary Jaccard距離；b-Bray-Curtis距離圖4 基于Binary Jaccard距離和Bray-Curtis距離的主坐標分析Fig.4 Principal coordinate analysis based on Binary Jaccard distance and Bray-Curtis distance

2.5 不同地區和顏色高溫大曲菌群差異比較

為比較不同顏色高溫大曲菌群群落結構的差異,分別使用Mann-Whitney秩和檢驗比較了同一地區不同顏色大曲菌群在屬水平的差異,結果如表1所示。

由表1可知,2個地區白曲中芽胞桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬(Weissella)的相對含量均顯著高于黃曲(P<0.05)。此外,在茅臺白曲中,明串珠菌屬(Leuconostoc)和溶桿菌屬(Lysobacter)的相對含量顯著高于黃曲(P<0.05),而糖多孢菌屬相對含量顯著低于黃曲(P<0.05)。為了分析不同地區高溫大群菌落結構差異,本研究進一步對2個地區相同顏色的大曲菌群在屬水平進行了Mann-Whitney秩和檢驗,結果如表2所示。

表1 相同地區不同顏色大曲間相對含量存在顯著差異的菌屬Table 1 Bacterial genera with significant differences in relative abundance between Daqu of the same region and different colors

表2 相同顏色不同地區大曲間相對含量存在顯著差異的菌屬Table 2 Bacterial genera with significant differences in relative abundance between Daqu of same color and different regions

由表2可知,堯治河大曲與茅臺大曲相比,芽胞桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)和無色桿菌屬(Achromobacter)的相對含量顯著較低(P<0.05)。此外,堯治河白曲中明串珠菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短波單胞菌(Brevundimonas)、溶桿菌屬和Anaerosalibacter的相對含量顯著低于茅臺白曲(P<0.05),堯治河黃曲中Apibacter相對含量顯著低于茅臺黃曲(P<0.05)。而嗜熱放線菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)在堯治河大曲中的相對含量顯著較高(P<0.05),同時糖多孢菌屬在堯治河白曲中的相對含量顯著高于茅臺白曲(P<0.05)。

2.6 高溫大曲發酵菌群相關性分析

為了揭示高溫大曲中發酵菌群彼此間的相關關系,本研究分別對茅臺和堯治河高溫大曲優勢菌屬進行了Spearman Rank相關性檢驗,彼此間具有顯著相關關系(P<0.05)的菌屬如圖5所示。

a-茅臺；b-堯治河圖5 茅臺和堯治河高溫大曲優勢菌屬相關性分析Fig.5 Correlation analysis of dominant bacterial genera in Maotai and Yaozhihe high-temperature Daqu

與堯治河大曲菌群相比,茅臺高溫大曲中菌群彼此間相關關系更強。在茅臺大曲中,芽胞桿菌屬與魏斯氏菌屬和明串珠菌屬之間具有顯著正相關性,而乳桿菌屬與寡養單胞菌(Stenotrophomonas)、無色桿菌屬彼此間呈顯著負相關關系。值得注意的是,同屬于變形菌門的勞爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養單胞菌、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)和無色桿菌屬彼此間存在顯著正相關關系。在堯治河大曲中,嗜熱放線菌屬與葡萄球菌屬呈顯著負相關關系,與Kroppenstedtia呈顯著正相關關系。此外,芽胞桿菌屬和魏斯氏菌屬彼此間也存在顯著正相關關系。

2.7 高溫大曲發酵菌群功能差異分析

本研究使用PICRUSt軟件對大曲中微生物的基因功能進行預測,并依據蛋白質COG進行功能注釋。所有大曲樣品共計注釋到4 792 COGs,這些COGs分別屬于23個功能大類,不同高溫大曲間存在顯著差異的功能大類如圖6所示。由圖6-a可知,茅臺白曲與黃曲相比,COG功能大類M、D、O、S、T、U、L和J顯著高于黃曲,COG功能大類K、E、I、Q、G顯著低于黃曲。而堯治河白曲和黃曲菌群COG功能大類之間不存在顯著差異。本研究進一步比較了相同顏色茅臺大曲與堯治河大曲菌群功能差異,結果顯示2個地區白曲功能差異較大(圖6-b),而黃曲功能較為相似(圖6-c)。具體而言,堯治河白曲與茅臺白曲相比,COG功能大類I、R、V、K、E相對豐度顯著較高,預示著其菌群對原料中的蛋白質和脂質潛在利用率更高,而O、M、U、T、S、Z顯著較低；此外,堯治河黃曲中COG功能大類V和R相對豐度顯著高于茅臺黃曲。

2.8 高溫大曲發酵菌群表型的差異分析

本研究使用BugBase工具對大曲中細菌表型進行預測,各組大曲表型分析結果如圖7所示。堯治河白曲和黃曲菌群所有表型均不存在顯著差異(P>0.05),而茅臺白曲和黃曲菌群表型差異較大。同時,2個地區間的酒曲菌群表型也存在較大差異。具體而言,茅臺白曲與黃曲相比,好氧菌、兼性厭氧菌、革蘭氏陽性菌相對豐度顯著較低,而革蘭氏陰性菌相對豐度顯著較高。堯治河高溫大曲與茅臺高溫大曲相比,厭氧菌、革蘭氏陽性菌、致病潛力相對豐度顯著較高,而生物膜形成、移動原件含量、革蘭氏陰性菌相對豐度顯著較低。

D-細胞周期控制,細胞分裂,染色體分割；E-氨基酸轉運和代謝；G-碳水化合物運輸和代謝；I-脂質運輸和代謝；J-翻譯、核糖體結構與生物合成；K-轉錄；L-復制、重組和修復；M-細胞壁/膜/包膜生物發生；O-翻譯后修飾,蛋白質周轉,伴侶；Q-次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝；R-一般功能預測預測；S-功能未知；T-信號轉導機制；U-細胞內運 輸、分泌和囊泡運輸；V-防御機制；Z-細胞骨架 a-茅臺白曲和黃曲;b-茅臺白曲和堯治河白曲;c-茅臺黃曲和堯治河黃曲圖6 不同地區和不同顏色高溫大曲菌群功能差異分析Fig.6 Functional difference analysis of high-temperature Daqu flora in different regions and colors

3 討論與結論

白酒的生產在我國呈現出明顯的地域區分,如赤水河產區孕育了茅臺、郎酒等醬香型白酒企業,而長江宜瀘產區則孕育了五糧液、瀘州老窖等濃香型白酒企業。由于白酒生產的區域性,國內的白酒科研團隊亦常立足于某一區域的釀酒基質微生物開展研究,加之部分釀酒基質的保密性和稀缺性,最終導致很少有研究將不同地域、不同企業所蘊含的釀酒微生物進行比較分析。近10年來,以454焦磷酸測序、Illumina MiSeq和HiSeq測序為代表的第二代高通量測序技術在發酵食品微生物多樣性解析中廣泛應用[13-15],產生了海量的測序數據,其中部分數據上傳至國際公共數據庫。作為中國三大名酒之一,茅臺酒在醬香型白酒中的地位不言而喻,多數醬香型白酒生產企業常以其作為標桿進行產品工藝的完善。本研究從國際公共數據庫中下載了茅臺大曲細菌多樣性的測序數據,同時將其與湖北省襄陽市堯治河楚翁泉酒業醬香型白酒高溫大曲的細菌群落結構、功能和表型進行了比較分析,一方面探究堯治河生產的高溫大曲與茅臺高溫大曲之間的共性和差異,另一方面亦期望為襄陽乃至湖北地區醬香型白酒高溫大曲制曲工藝的改良提供數據支撐和尋求方向。

本研究結果顯示,2個地區的高溫大曲細菌主要由芽胞桿菌屬、嗜熱放線菌屬、葡萄球菌屬、Kroppenstedtia等組成,優勢菌群種類與之前的研究結果基本一致[16-17],這些菌屬代表了高溫大曲中3個主要的微生物組成部分：嗜熱菌(嗜熱放線菌屬和Kroppenstedtia)、原料中的優勢菌(芽胞桿菌屬)和加工環境優勢菌(葡萄球菌屬)。嗜熱放線菌屬和Kroppenstedtia耐熱能力強,在高溫大曲中經常被檢測到。嗜熱放線菌屬具有提供豐富風味物質和風味前體的潛在功能[18],例如,隸屬于嗜熱放線菌屬的普通嗜熱放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)和糖化嗜熱放線菌(Thermoactinomycessacchari)不僅具有分泌淀粉酶、酯酶、纖維素酶、果膠酶和磷酸酶的能力,而且還能產生具有醬香味的風味物質,這對于白酒最終的風味至關重要[19-20]。然而,目前對于Kroppenstedtia的發酵特性鮮有報道,需要進一步的研究揭示。芽胞桿菌屬是各類白酒發酵中的常見菌和優勢菌,芽胞桿菌分泌的淀粉酶和蛋白酶能將淀粉和蛋白質轉化為葡萄糖和氨基酸,促進白酒發酵過程中風味化合物前體如2-5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的形成[21-23],因此其對于白酒發酵亦非常重要。之前基于醬油和韓國豆醬的研究發現,葡萄球菌屬在發酵過程中可以提供各種酶和抗菌潛力[24-25],因此該菌屬在白酒發酵中可能也具有一定的作用。值得注意的是,高溫大曲核心菌群的分析結果顯示,雖然在屬水平2個地區的大曲優勢菌群類似,但在更精細化的分類學水平上,如種水平或者株水平,兩者之間存在較大差異；同時茅臺大曲中存在較大比例的獨有菌群,這應該是導致后續分析中2個地區大曲菌群功能存在較大差異的重要原因之一。

α多樣性結果表明,堯治河高溫大曲中微生物的豐度和多樣性均顯著低于茅臺大曲。β多樣性結果證實了2個地區大曲的群落結構亦存在明顯的區別,且這種區別主要體現在白曲上。眾所周知,黃色大曲形成的溫度要高于白色大曲,因而為了尋找導致2個酒企高溫大曲菌群群落結構差異的原因,本研究首先確認了溫度(顏色)與大曲菌群之間的關系。結果發現,大曲中芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和溶桿菌屬的相對含量均隨著溫度的升高而下降,而糖多孢菌屬相對含量隨著溫度升高而升高。通過對比堯治河和茅臺酒曲中的差異菌群,如嗜熱放線菌屬和糖多孢菌屬在堯治河酒曲中的相對含量顯著較高,而芽胞桿菌屬和乳桿菌屬相對含量顯著較低,我們不難推測導致堯治河酒曲與茅臺酒曲菌群群落結構差異的一個重要因素是堯治河制曲時的發酵溫度相較茅臺酒曲更高。菌群相關性分析結果表明,茅臺酒曲菌群間存在更為密切的相關關系,這一方面有利于酒曲中菌群群落結構的穩定[26],同時大量菌屬彼此間存在顯著正相關關系,對于微生物彼此相互協作產生豐富的代謝產物也具有積極作用,這可能是茅臺酒風味幽雅細膩、持久穩定、回味悠長的關鍵因素之一。

a-好氧菌；b-厭氧菌；c-兼性厭氧菌；d-生物膜形成；e-移動元件；f-革蘭氏陰性菌；g-革蘭氏陽性菌；h-致病潛力；i-脅迫耐受圖7 不同地區和顏色高溫大曲菌群表型差異分析Fig.7 Phenotypic difference analysis of high-temperature Daqu in different regions and colors

高溫大曲發酵菌群功能分析結果表明,黃曲中菌群的功能大類如E、I、Q、G相對豐度顯著較高,這些功能對于菌群降解原料中的淀粉和蛋白質及產生次級代謝產物至關重要,這可能是黃色大曲用于醬香型白酒生產時產品品質最佳的原因[27],而白曲中相對含量顯著較高的的功能如M、D、O、T、U、L和J更多的與菌群的生產繁殖有關,表明白曲中微生物彼此間的生長競爭更加激烈[28]。高溫大曲發酵菌群表型分析結果顯示,堯治河高溫大曲中革蘭氏陽性菌和致病潛力相對含量顯著較高(P<0.05),這與堯治河大曲中嗜熱放線菌屬和葡萄球菌屬的相對含量較高有關。同時,其菌群移動元件相對含量顯著較低,這表明堯治河高溫大曲中菌群對發酵環境的適應性要弱于茅臺[29]。

綜上所述,堯治河高溫大曲制作溫度相較茅臺大曲更高,同時大曲中的重要發酵菌屬芽胞桿菌屬相對含量顯著較低,因此,在后續的制曲過程中適當降低制曲溫度,同時嘗試具有優良發酵特性芽胞桿菌屬的外源添加,可能對提升堯治河醬香型大曲及最終白酒的品質具有積極的意義。值得一提的是,由于本研究所選取的OTU劃分方式、比對數據庫和計算參數等與原來的研究可能不盡相同,因此可能導致本研究的部分結果與原有研究報道稍有不同。