膳食血紅素鐵促進(jìn)結(jié)直腸癌變機(jī)制初探

陳宣承,李紅領(lǐng),李海濤

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

結(jié)腸直腸癌(carcinoma of colon and rectum,CRC)是第二大流行癌癥[1],死亡率逐年上升,且發(fā)病情況日漸趨于年輕化[2],影響CRC發(fā)病的因素極為復(fù)雜,飲食、腸道菌群、個(gè)體情緒甚至生物鐘均會(huì)有一定的影響,因此了解CRC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制對(duì)于預(yù)防及治療CRC至關(guān)重要。攝入紅肉對(duì)患結(jié)腸直腸癌有重大風(fēng)險(xiǎn)[3],紅肉中的血紅素鐵可以解釋紅肉攝入與結(jié)腸直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,因?yàn)榘兹?如雞肉、魚(yú)肉等)的攝入并不會(huì)加大CRC的患病風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。膳食血紅素鐵主要存在于紅肉中的血紅蛋白和肌紅蛋白,可在小腸部位被吸收[7]。血紅素鐵是一種廣泛存在于動(dòng)物紅肉、肝臟、血液中的有機(jī)鐵,血紅素(亞鐵原卟啉,Fe2+)是一個(gè)在其中心含有亞鐵離子的四吡咯環(huán),而氯化血紅素(鐵原卟啉,Fe3+)含有3價(jià)鐵,是血紅素的體外純化形式[8-9]。含血紅素的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,如氧氣運(yùn)輸和儲(chǔ)存(如血紅蛋白和肌紅蛋白),參與藥物代謝(如細(xì)胞色素P450),抗氧化能力(如乳酸鹽酶,過(guò)氧化物酶)和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程(如一氧化氮合成酶)[10-12]。已有研究表明,氯化血紅素對(duì)人結(jié)腸細(xì)胞具備遺傳毒性和細(xì)胞毒性[13],同時(shí),通過(guò)藥物抑制或基因敲除轉(zhuǎn)鐵蛋白DMT1,減少結(jié)腸細(xì)胞對(duì)2價(jià)鐵的吸收,可以有效減少結(jié)腸腫瘤的發(fā)生[14]。這些研究表明,鐵平衡對(duì)結(jié)腸直腸癌的發(fā)生至關(guān)重要。

目前主要有3種機(jī)制可以解釋肉類(lèi)和結(jié)直腸癌之間的關(guān)系[15],(1)可能通過(guò)肽衍生的胺的N-亞硝化作用或在胃腸道中形成潛在的致癌性物質(zhì)N-亞硝基化合物,通過(guò)亞硝化作用產(chǎn)生S-亞硝基硫醇和亞硝酰基鐵(FeNO)[16]；(2)在高溫下煮熟的肉含有誘變性雜環(huán)胺(mutagenic heterocyclic amine,HCA)[17]；(3)流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持紅肉中存在的血紅素鐵可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,血紅素對(duì)上皮細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性、基因毒性效應(yīng),以及血紅素鐵對(duì)N-硝基化合物和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物形成的催化作用[18]。然而,在采用流行病學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析時(shí),會(huì)出現(xiàn)一定偏差,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。

本研究以血紅素鐵為研究對(duì)象,通過(guò)建立動(dòng)物模型以及細(xì)胞模型,探究血紅素鐵的攝入對(duì)結(jié)腸直腸癌的發(fā)生發(fā)展的影響,以及巨噬細(xì)胞在結(jié)腸直腸癌發(fā)生中的影響。研究成果提出一種血紅素鐵對(duì)CRC發(fā)病的新的機(jī)制解析,為結(jié)腸直腸癌的預(yù)防及治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6 N雄性小鼠,5周齡,體重20～22 g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1,ATCC細(xì)胞庫(kù)(the global bioresource center)。

1.1.3 抗體

重組Anti-Xanthine Oxidase抗體(XOD,ab109235)、重組Anti-gamma H2A.X 抗體(p-H2AX,ab81299)、重組Anti-STAT3(phospho Y705)抗體,Abcam；F4/80抗體C-7(F4/80,sc—377009),Santa(santa cruz biotechnology)；β-actin(4970),CST(cell signaling technology)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測(cè)試盒、脂質(zhì)過(guò)氧化物(lipid hydroperoxide,LPO)試劑盒及組織鐵測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活性檢測(cè)試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；Mouse TNF-α ELISA Kit、Mouse IL-10 ELISA Kit,南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；小鼠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司；免疫組化試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),無(wú)錫萊弗思生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS),南京百思凱科技有限公司；氯化血紅素,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖鐵,山西普德藥業(yè)有限公司；polymethacrylate copolymer(PMA),西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 利用AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型實(shí)驗(yàn)

5周齡SPF級(jí)C57BL/6 N雄性小鼠,飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障環(huán)境中,在屏障環(huán)境中適應(yīng)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分組。在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的血紅素鐵劑量(50、100 mg/kg)對(duì)應(yīng)醫(yī)學(xué)用藥中劑量。模型組、低劑量血紅素鐵組(50 mg/kg)以及高劑量血紅素鐵組(100 mg/kg)各15只接受單次AOM(10 mg/kg,200 μL)的腹腔注射,空白組及對(duì)照組(100 mg/kg)各6只接受注射同體積9 g/L的NaCl溶液。同時(shí),對(duì)照組和干預(yù)組開(kāi)始灌胃相應(yīng)濃度的氯化血紅素水溶液,與此同時(shí),空白組和模型組每次每只灌胃200 μL 9 g/L的NaCl溶液,每灌胃5 d休息1 d,持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。1周后,模型組和干預(yù)組將水壺中的飲用水替換為質(zhì)量濃度為20 g/L的DSS(分子質(zhì)量為35 000～50 000 Da)水溶液,2 d換1次,空白組和對(duì)照組維持普通飲用水,持續(xù)1周,將DSS水溶液換回普通飲用水,再飼養(yǎng)2周,視為1個(gè)循環(huán),上述循環(huán)重復(fù)2次,總計(jì)3次循環(huán)。最后1次循環(huán)結(jié)束后,飼喂2周,隨后根據(jù)動(dòng)物福利原則處死小鼠,眼球采血,對(duì)結(jié)腸、脾器官等進(jìn)行分離,40 g/L多聚甲醛-PBS固定及液氮冷凍保存,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠結(jié)直腸組織標(biāo)本制作以及蘇木精—伊紅染色實(shí)驗(yàn)

在AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中,各組小鼠經(jīng)過(guò)麻醉處死后,取下結(jié)直腸,縱剖攤平,緊密卷起,依次完成脫水、透明、浸蠟、包埋及切片步驟后,完成標(biāo)本的制作。標(biāo)本再經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明及封片等步驟,于掃描顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化(immunocytochemistry,IHC)分析

標(biāo)本經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟、復(fù)水后,在體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2溶液中浸泡10 min,再用清水浸泡2次洗滌,再檸檬酸鈉溶液中煮沸3 min,冷卻至室溫,完成抗原修復(fù)后,水洗2次,再用PBS溶液浸泡(2×5 min),使用5%的BSA-PBS溶液封閉1 h,棄去封閉液,施加一抗(XOD、F4/80抗體,1∶200稀釋),在濕潤(rùn)的水盒中4 ℃過(guò)夜孵育,再按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)要求施加二抗、顯影、復(fù)染,最后使用不同濃度酒精、二甲苯梯度脫水,封片,在掃描顯微鏡下掃描觀察。

1.2.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

人髓系白血病單核細(xì)胞THP-1在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下,用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以每皿5×105接種于10 cm皿,過(guò)夜后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h穩(wěn)定細(xì)胞代謝,之后經(jīng)100 ng/mL PMA誘導(dǎo)24 h,再將含0.2 μg/mL LPS及蔗糖鐵(75、150 μmol/L)的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞,6 h后收集細(xì)胞蛋白,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 蛋白提取

對(duì)于小鼠結(jié)腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結(jié)腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個(gè)樣品提取30 mg,加入30倍體積含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的Ripa裂解液進(jìn)行裂解,組織研磨后,12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,吸取上清液,部分上清液按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,剩余樣品加入體積分?jǐn)?shù)5%的β-巰基乙醇的5×loading buffer后,95 ℃金屬浴加熱變性10 min,后續(xù)備用；對(duì)于細(xì)胞樣品,收集貼壁細(xì)胞及上清液,1 000 r/min離心5 min,PBS清洗3遍,以洗去多余培養(yǎng)基,后用含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的Ripa裂解液進(jìn)行裂解,經(jīng)超聲破碎儀充分裂解后,12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,吸取上清液,后續(xù)按組織蛋白提取步驟提取蛋白,后續(xù)備用。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(western blot)分析

30 μg蛋白樣品變性后經(jīng)10%SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用含有5% BSA的TBST溶液(TBS水溶液,含有1%體積分?jǐn)?shù)的吐溫-20)封閉1 h,施加一抗(XOD、p-stat3、H2AX、β-actin抗體,1∶1 000稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育；再施加二抗孵育1 h(1∶2 500稀釋)后,再用TBST水溶液洗滌5次,每次5 min,最后加入顯影液,避光顯影20 s后,在掃描儀下顯影掃描觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 小鼠結(jié)腸部位MPO、LPO及組織鐵含量測(cè)定

對(duì)于小鼠結(jié)腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結(jié)腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個(gè)樣品提取90 mg,加入20倍體積生理鹽水,組織研磨后,棄沉淀,吸取上清液,部分上清液按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定,其余樣品按MPO測(cè)試盒、LPO試劑盒及組織鐵測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定結(jié)腸組織MPO酶活、LPO含量以及結(jié)腸組織鐵含量,具體計(jì)算按說(shuō)明書(shū)給與公式得出相應(yīng)結(jié)果。

1.2.8 小鼠結(jié)腸部位TNF-α及IL-6含量測(cè)定

對(duì)于小鼠結(jié)腸樣品,每組挑選4只小鼠樣品,模型組、低劑量血紅素鐵組和高劑量血紅素鐵組則按結(jié)腸腫瘤組織和瘤旁組織提取,每個(gè)樣品提取60 mg,加入20倍體積PBS,組織研磨后,棄沉淀,吸取上清液,按Mouse TNF-α ELISA Kit和Mouse IL-6 ELISA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)量結(jié)腸部位TNF-α及IL-6含量。

1.2.9 小鼠血漿LPS含量測(cè)定

對(duì)小鼠血漿樣品,每組挑選4只小鼠樣品,每個(gè)樣品吸取100 μL血漿,用LPS試劑盒中稀釋液2倍稀釋后,按相應(yīng)說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿中LPS含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05,表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素鐵攝入增加結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)度

對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),建立AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型,并用不同濃度的氯化血紅素灌胃干預(yù),圖1-a為實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。將小鼠分組為空白組(1)、血紅素鐵對(duì)照組(2)、模型組(3)、低血紅素鐵干預(yù)組(4)以及高血紅素鐵干預(yù)組(5)，并在下文統(tǒng)一用序號(hào)1-5代替組別，其中空白組及血紅素鐵對(duì)照組各5只小鼠，模型組、高低劑量血紅素鐵干預(yù)組各10只小鼠。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期平均體重記錄如圖1-b所示,經(jīng)過(guò)13周的灌胃干預(yù),空白組平均體重為(31.57±1.81) g,模型組為(29.78±2.03) g,對(duì)照組為(31.65±1.94) g,低劑量血紅素鐵干預(yù)組為(29.31±2.04) g,高劑量血紅素鐵干預(yù)組為(28.50±2.11) g(與模型組比較,P<0.05,單因素方差分析t檢驗(yàn))。由3位具備小鼠結(jié)直腸病理分析經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)小鼠結(jié)直腸腫瘤部位的結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明高劑量血紅素鐵干預(yù)組結(jié)節(jié)數(shù)明顯多余模型組(圖1-d),同時(shí)觀察小鼠結(jié)直腸內(nèi)表面發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵干預(yù)組有較大腺瘤生成,以及發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵組小鼠脾臟質(zhì)量明顯較模型組偏高(圖1-c),這說(shuō)明血紅素鐵具有增加結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生率的作用。隨后,通過(guò)對(duì)結(jié)直腸組織的病理學(xué)評(píng)估,發(fā)現(xiàn)高劑量血紅素鐵干預(yù)組小鼠結(jié)直腸病灶的結(jié)腸細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,隱窩破壞明顯,呈纖維狀,有較大的腺瘤生成,而模型組小鼠結(jié)直腸病灶部位細(xì)胞形態(tài)變化較小,同時(shí)腺瘤體積較小(圖1-e),說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)劑量下的血紅素鐵可以加重結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。而對(duì)照組相對(duì)空白組則未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。

2.2 血紅素?cái)z入增加組織鐵含量及氧化應(yīng)激水平

鐵一向被認(rèn)為是氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化生成的催化劑,在AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型中,通過(guò)測(cè)量小鼠不同部位結(jié)腸組織鐵含量,發(fā)現(xiàn)血紅素鐵的攝入會(huì)增加結(jié)直腸組織鐵含量,且跟濃度呈正相關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌腫瘤小鼠中,腫瘤組織較瘤旁組織鐵含量更高(圖2-c)。通過(guò)測(cè)定小鼠氧化應(yīng)激水平發(fā)現(xiàn),MPO活性(圖2-b)和LPO含量(圖2-a)均上升,且腫瘤組織較瘤旁組織鐵含量更高,這與組織鐵含量表現(xiàn)一致,說(shuō)明小鼠氧化應(yīng)激的變化可能是因?yàn)殡S著血紅素鐵的攝入,結(jié)腸部位組織鐵含量的增加引起的。

圖1 血紅素鐵攝入對(duì)結(jié)直腸癌的影響Fig.1 Influence of hemin intake on CRC 注:*,表示差異顯著(P<0.05); **,表示差異極顯著(P<0.01); ***,表示差異高度顯著(P<0.001),(下同)

a-LPO含量；b-MPO活性；c-鐵含量圖2 結(jié)腸組織鐵及氧化應(yīng)激水平分析Fig.2 Analysis of iron and oxidative stress levels in colon

2.3 血紅素鐵攝入對(duì)結(jié)腸組織炎癥因子的影響

在AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型中,通過(guò)測(cè)量小鼠不同部位結(jié)腸組織鐵含量發(fā)現(xiàn),在腫瘤組織中TNF-α表達(dá)量較瘤旁組織顯著提高,但不同組別間TNF-α的含量上升幅度不大(圖3-a),同時(shí),腫瘤組織較瘤旁組織白細(xì)胞介素6的表達(dá)上調(diào),且模型組較空白組表達(dá)上調(diào),且經(jīng)過(guò)血紅素鐵的干預(yù)后,干預(yù)組及對(duì)照組均有不同程度上調(diào)(圖3-b)。不同組別間的小鼠炎癥變化程度小,這是因?yàn)锳OM/DSS模型是一種慢性炎癥,炎癥程度較氧化應(yīng)激相對(duì)較弱。

2.4 血紅素鐵上調(diào)的氧化應(yīng)激依賴XOD表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)血紅素鐵會(huì)引起氧化應(yīng)激水平的提高,XOD下游產(chǎn)物H2O2可在小腸黏膜細(xì)胞與亞鐵離子發(fā)生芬頓反應(yīng)[19],能夠促進(jìn)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和運(yùn)輸,也能催化生成氧自由基。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析發(fā)現(xiàn),血紅素鐵的存在可以上調(diào)高劑量干預(yù)組結(jié)腸組織XOD的表達(dá),同時(shí)觀測(cè)到DNA損傷的標(biāo)志蛋白磷酸化的H2AX上調(diào),以及磷酸化STAT3蛋白較空白組高,高血紅素鐵組磷酸化STAT3蛋白較模型組表達(dá)上調(diào)(圖4-a)。通過(guò)測(cè)量小鼠結(jié)腸組織XOD活性,也得到了類(lèi)似結(jié)果,高、低劑量干預(yù)組XOD活性較模型組顯著上升(圖4-b)。

2.5 XOD表達(dá)定位

結(jié)腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞均在腸道產(chǎn)生XOD,為了進(jìn)一步探究結(jié)腸組織XOD表達(dá)的具體情況,通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)確定XOD在結(jié)腸部位表達(dá)位置,通過(guò)XOD抗體和F4/80,發(fā)現(xiàn)F4/80定位的巨噬細(xì)胞與XOD表達(dá)位置高度重合(圖5-a),這說(shuō)明結(jié)腸部位檢測(cè)到的絕大部分XOD來(lái)源于巨噬細(xì)胞。血漿LPS的含量可作為結(jié)腸屏障是否破壞的一個(gè)標(biāo)志,實(shí)驗(yàn)首先測(cè)量了血漿中LPS含量,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)AOM/DSS誘導(dǎo)后,模型組和干預(yù)組小鼠血漿中LPS均出現(xiàn)上升(圖5-b),這說(shuō)明攝入膳食血紅素鐵后,腸道屏障被破壞,給巨噬細(xì)胞提供了通道,接觸到鐵的巨噬細(xì)胞發(fā)生一系列生物生化反應(yīng)。

a-TNF-α；b-IL-6圖3 結(jié)腸組織炎癥因子水平分析Fig.3 Analysis of inflammatory factor levels in colon

a-Western Blot分析；b-XOD活性圖4 結(jié)腸組織Western Blot及XOD活性分析Fig.4 Western Blot of colon tissue and XOD activity

為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)腸細(xì)胞的影響,建立細(xì)胞模型,通過(guò)PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞,在蔗糖鐵和LPS刺激下,發(fā)現(xiàn)XOD表達(dá)顯著提高,且有劑量依賴現(xiàn)象,呈正相關(guān)趨勢(shì)(圖5-c)。這與前文中小鼠由于腸道屏障的破壞,塑造了細(xì)菌脂多糖接觸巨噬細(xì)胞的一個(gè)環(huán)境相對(duì)應(yīng),與其相互驗(yàn)證。

a-結(jié)腸組織顯微圖片；b-血漿脂多糖含量；c-細(xì)胞系Western Blot分析圖5 結(jié)腸組織免疫組化、血漿脂多糖及THP-1細(xì)胞系Western Blot分析Fig.5 Analysis of IHC,LPS and Western Blot of THP-1 cell line

3 討論

世界癌癥研究小組認(rèn)為紅肉和加工肉攝入會(huì)加大患結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[20],目前,不僅在發(fā)達(dá)國(guó)家,在中等收入及低收入國(guó)家結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在逐年上升[21]。而有研究表明紅肉中對(duì)結(jié)腸直腸癌起促進(jìn)作用的不是血紅蛋白而是血紅素鐵[22],本實(shí)驗(yàn)研究表明,膳食血紅素鐵對(duì)腸道屏障具有短期影響,對(duì)結(jié)腸黏膜中炎癥、滲透性和細(xì)胞毒性增加,血紅素鐵可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而氧化應(yīng)激可以通過(guò)黃嘌呤氧化酶的過(guò)度表達(dá)來(lái)增加。

膳食血紅素鐵的攝入不僅增加了結(jié)腸炎癥和氧化應(yīng)激(如MPO活性和促炎性細(xì)胞因子的增加),而且還增加了DNA損傷和腸道通透性。有研究表明,炎癥與某些形式的癌癥發(fā)展有因果關(guān)系,其過(guò)程涉及組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧的遺傳毒性,或通過(guò)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子(例如IL-1β)[23]。與這些研究一致的是,攝入紅肉與結(jié)直腸癌發(fā)生和氧化應(yīng)激增加有關(guān),例如血漿C反應(yīng)蛋白[24]和糞便水的遺傳毒性[25]。黃嘌呤氧化酶衍生的氧自由基和H2O2均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化,進(jìn)而直接或間接改變信號(hào)傳導(dǎo)途徑,破壞細(xì)胞膜完整性來(lái)影響腸道穩(wěn)態(tài)[26],因此本文通過(guò)測(cè)量結(jié)腸部位黃嘌呤氧化酶的表達(dá)和活性,定位到黃嘌呤氧化酶的變化來(lái)自于巨噬細(xì)胞,解釋了導(dǎo)致結(jié)腸穩(wěn)態(tài)破壞的源頭是黃嘌呤氧化酶。

本研究突出了黃嘌呤氧化酶在膳食血紅素鐵干預(yù)下對(duì)AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠的作用。總之,紅肉的攝入與結(jié)直腸癌發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān),這是因?yàn)榧t肉中血紅蛋白較白肉高10倍[27],血紅素鐵正是紅肉和結(jié)直腸癌發(fā)生高風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)所在。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,在AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)血紅素鐵干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)直腸癌腫瘤的個(gè)數(shù)明顯增多,同時(shí)體重下降幅度更大,腫瘤發(fā)育程度大,健康小鼠給予血紅素鐵干預(yù)后,體征未出現(xiàn)異常；在體外THP-1細(xì)胞模型中研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞,在單純蔗糖鐵的刺激下,黃嘌呤氧化酶出現(xiàn)明顯變化,但在蔗糖鐵和LPS的共同刺激下,黃嘌呤酶表達(dá)量顯著上升,且隨蔗糖鐵濃度升高表達(dá)量變多。深入研究發(fā)現(xiàn),紅肉攝入會(huì)引起細(xì)胞黃嘌呤氧化酶表達(dá)和活性上調(diào),增加氧化應(yīng)激水平,在動(dòng)物模型中,也能觀察到此種現(xiàn)象,血紅素鐵的攝入會(huì)增加機(jī)體氧化應(yīng)激水平,破壞腸道屏障,鐵與巨噬細(xì)胞的接觸導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加,進(jìn)而造成DNA損傷,增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。本文研究成果對(duì)紅肉攝入加大結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制作出了一種可能的解釋,發(fā)現(xiàn)黃嘌呤氧化酶在結(jié)直腸癌疾病中是一個(gè)重要靶點(diǎn),為紅肉攝入誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了一些新思路。