攀枝花和會東地區中華塊菌營養成分檢測及含量差異化分析

余曉瑞,裴滬榮,龍力,方磊,龍章富

(四川大學 生命科學學院,四川 成都,610065)

塊菌(Truffle)是一種珍稀食藥兩用真菌,屬于盤菌綱(Discomycetes)、塊菌目(Tuberales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)[1]。目前我國已發現的塊菌資源有60余種,其中西南地區資源最為豐富[2],而攀枝花和會東是我國最早開發塊菌資源的地區。國產黑塊菌包括印度塊菌復合種、中華夏塊菌、假凹陷塊菌等,其中中華塊菌屬于印度塊菌復合種[3]。

塊菌子實體中含有豐富的蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素等成分,塊菌含有能夠增強機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等活性成分[4-5]。塊菌中所含的尿苷能作為藥物治療貧血以及心血管方面的疾病,肌醇能夠降低膽固醇、促進毛發生長、供給腦細胞營養等,花生四烯酸在維持機體細胞膜的結構與功能方面發揮著重要的作用[6]。目前國內塊菌研究主要集中在對塊菌形態、孢子形態以及揮發性物質研究,且以塊菌干品為對象的研究較多,對新鮮塊菌以及攀枝花地區和會東地區塊菌成分差異性對比分析的相關研究較少,傳統方法無法有效區分塊菌產地,內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)鑒定的方法適合于真菌物種的鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的鑒定分析,會東和攀枝花的中華塊菌在ITS間隔區上差異較小,所以只用ITS分子鑒定法不能區分兩地中華塊菌。

本文利用GC-MS技術對來自攀枝花和會東地區的中華塊菌組成成分和含量進行檢測,通過主成分分析方法(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘分析法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進行化學計量學分析,分析了兩地塊菌的組成成分、對比了兩地成分含量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塊菌(新鮮),分別采自涼山州會東縣嘎吉鎮,攀枝花市中壩鄉(2021年1月,經ITS鑒定為中華塊菌)。

會東嘎吉鎮：屬中亞熱帶濕潤季風氣侯區,光熱資源豐富,四季如春,晝夜溫差大,雨量集中,干濕季分明,多年平均降水量1 058 mm,雨熱同季,地貌氣候復雜多樣,垂直差異十分明顯。

攀枝花中壩鄉：屬于亞熱帶季風及南亞熱帶亞濕潤氣候,夏季長,日溫差大,年溫差小,降雨少而集中,冬半年日照充足,少雨干暖；夏半年云雨較多,氣候涼爽；由于地形的多樣性,氣候垂直差異顯著。

甲醇、乙腈、己烷、異丙醇、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、三甲基一氯硅烷、甲氧基胺鹽酸鹽、吡啶、肉豆蔻酸(D27,98%),美國默克公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、5975C MSD質譜儀、DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 塊菌樣品準備

對來自攀枝花市的新鮮塊菌組編號為PZH-B組,會東縣的新鮮塊菌組為PZH-S組。每組3個重復。

1.3.2 GC-MS樣本的制備

稱量5 mg塊菌樣本,加入1 mL提取劑[V(異丙醇)∶V(乙腈)∶V(水)=3∶2∶2],加入5 μL 3 mg/mL肉豆蔻酸(D27,98%)溶液,渦旋 1 min；4 ℃,13 000 r/min離心5 min,取800 μL上清液氮吹干燥。

衍生化處理：首先加入20 μL 40 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽/吡啶,30 ℃衍生90 min；接著加入90 μL含體積分數1%三甲基一氯硅烷的N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺,37 ℃衍生 30 min,4 ℃離心(13 000 r/min)5 min,取60 μL的上清液上機檢測。

1.3.3 檢測條件

采用Agilent DB5-MS(30 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱,體積流量1.1 mL/min,分流比為10∶1,進樣口溫度250 ℃,接口溫度230 ℃。色譜柱升溫方式為程序升溫,起始溫度60 ℃,保持1 min。以10 ℃/min的速率升到300 ℃,保持10 min。質譜條件：離子源溫度250 ℃,四級桿溫度150 ℃,溶劑延遲5.9 min,檢測范圍m/z50～500。

1.3.4 數據處理

將采集到的原始數據使用Agilent Chrom Station software(Agilent Technologies,USA)轉換成通用格式。在R軟件平臺下,進行峰的識別,保留時間對齊,自動積分等預處理。使用夢圖數據庫進行數據圖譜對比,匹配度大于80%作為鑒定依據,對所測的成分進行定性定量分析。

2 實驗結果

2.1 攀枝花和會東地區中華塊菌的PCA

本研究將PZH-B和PZH-S兩組通過GC-MS檢測得到的成分進行主成分分析,結果如圖1所示。PC-1(49.6%)與PC-2(21.7%)累計方差貢獻率為71.3%,說明降維時保留了GC-MS結果的主要有用信息,能夠較好地反映結果信息。PZH-B和PZH-S兩組團聚性都較差,PC-1與PC-2未能將PZH-B組和PZH-S組分離開,表明攀枝花中華塊菌和會東中華塊菌的組成成分差異小。

圖1 攀枝花和會東塊菌主成分分析Fig.1 PCA of T.sinense (Panzhihua) and T.sinense (huidong)

2.2 攀枝花和會東中華塊菌中檢測出的氨基酸

選取攀枝花地區和會東地區1月的新鮮塊菌組織進行GC-MS檢測,將得到的產物進行分類,攀枝花地區塊菌和會東地區塊菌共鑒定出15種氨基酸,如表1所示。

表1 兩地塊菌中檢測出的氨基酸成分Table 1 Amino acid components detected in truffles from two areas

15種氨基酸中有8種為必需氨基酸：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸；7種為非必需氨基酸：脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、賴氨酸。氨基酸是塊菌特征風味化合物之一。其中天冬氨酸是鮮味型；蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸是甜味型；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸是苦味型。陶愷等[7]在對中國塊菌的營養價值鑒定中表明,中國塊菌蛋白質含量豐富,富含人體所需的8種必需氨基酸,而黑孢塊菌中甲硫氨酸未被檢測出；任新軍等[8]在對中華夏塊菌、假喜馬拉雅塊菌、攀枝花白塊菌的氨基酸檢測中未檢測出半胱氨酸。不同地區的塊菌氨基酸成分不同可能與當地氣候環境、降水等因素有關。

2.3 攀枝花和會東中華塊菌中的糖類測定

選取攀枝花地區和會東地區1月的新鮮塊菌組織進行GC-MS檢測,將得到的產物進行分類,攀枝花地區塊菌和會東地區塊菌共鑒定出10種糖類(表2),分別為巖藻糖、2-脫氧-L-核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、N-乙酰氨基葡萄糖、棉子糖。糖類是塊菌成分中重要的組成成分之一,塊菌抗氧化活性、調節機體免疫力、抗腫瘤抗癌的作用都與其體內的多糖有關。李美鳳等[9]在對塊菌的多糖提取、分離和結構鑒定實驗中表明塊菌多糖是由甘露糖、葡萄糖和鼠李糖組成,其中葡萄糖的含量高達95%。BHOTMANGE等[10]對塊菌多糖進行提取的實驗中表明,鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖是多種塊菌多糖的重要組成成分；有的塊菌也含有特殊多糖,如巖藻糖、阿拉伯糖,如印度塊菌、棕紅塊菌[11-12]。

表2 兩地塊菌中檢測出的糖類成分Table 2 Saccharides detected in truffles from two areas

2.4 攀枝花和會東縣塊菌中的有機酸

選取攀枝花地區和會東地區1月的新鮮塊菌組織進行GC-MS檢測,將得到的產物進行分類,攀枝花地區塊菌和會東地區塊菌共鑒定出22種有機酸(表3),有機酸類化合物可作用于中樞神經,具有抗菌,升高白細胞等作用[13]。ANGELINIA等[14]研究表明,多不飽和脂肪酸是塊菌脂肪酸的主要成分,主要為亞油酸、油酸、硬脂酸、棕櫚酸。

表3 兩地塊菌中檢測出的有機酸Table 3 Organic acids detected in truffles from two areas

2.5 攀枝花和會東中華塊菌組成成分含量分析

將PZH-S組和PZH-B組中的6個新鮮松露樣本進行PLS-DA分析,找到2組之間的差別。圖2為PLS-DA分析成分含量差異的載荷圖,能夠反映組成成分對樣本組間區分的貢獻度,成分在loading 1和loading 2方向上離中心點(0,0)越遠對區分樣本組所作的貢獻越大,通過圖2可以看出,肌醇半乳糖苷、山梨醇、反油酸乙酯等多個組成成分距離中心點較遠,它們對樣本區分做出了突出貢獻。通過這些有差異的物質可以對PZH-B組與PZH-S組進行區分。

圖2 PLS-DA組成成分含量差異載荷圖Fig.2 PLS-DA loading plot of different component

圖3為2組具有顯著性差異的15種組成成分及其在2組中的含量對比圖,變量投影重要性指標(variable importance in projection,VIP)值越大,該成分在樣本的區分中所作的貢獻越大,紅色為相對高濃度,藍色為相對低濃度。通過圖3可以看出,PZH-B與PZH-S在15種組成成分上有顯著差異,并對這15種組成成分在2組中含量的高低做出了對比。在15種組成成分中,有10種成分PZH-S組含量高于PZH-B組,有5種PZH-B組含量高于PZH-S組。其中差異最大的組成成分為肌醇半乳糖苷,PZH-S組含量高于PZH-B組。PZH-S組中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、異亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亞油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于PZH-B組。張世奇等[15]的研究中表明9-(E)-十八烯酸是會東塊菌的主要香氣成分之一。香氣成分是塊菌的品種重要指標之一,產地對食用菌的香氣成分含量有重要影響[16-17]。1-辛烯-3-醇是大多數食用菌的重要芳香化合物之一,而亞油酸是合成1-辛烯-3-醇的前體[18]。本研究中對兩地中華塊菌成分含量通過PLS-DA進行差異成分分析,共找到了15種差異成分,肌醇半乳糖苷、尿苷、肌醇、亞氨基二乙酸、山梨醇、2-哌啶甲酸、正亮氨酸、亞油酸、異亮氨酸、3-羥基-吡啶、脯氨酸、9-(E)-十八烯酸、花生四烯酸、2-氨基-2-去甲菠烷羧酸、亮氨酸。其中,會東地區中華塊菌在9-(E)-十八烯酸和亞油酸的含量上都高于攀枝花地區的塊菌。

圖3 顯著性差異的組成成分及其在2組中的含量對比圖Fig.3 Comparison of components with significant differences in content in truffles from two areas

3 結論

本文通過攀枝花和會東地區的中華塊菌進行GC-MS檢測,共檢測出了15種氨基酸,其中8種為必需氨基酸。在會東和攀枝花塊菌中檢測出了10種糖類,在兩地中均檢測出巖藻糖,它是松露多糖的重要組成成分。在會東和攀枝花中華塊菌中檢測出22種有機酸,多為不飽和脂肪酸。在15種含量差異化組成成分中,有10種成分會東組含量高于攀枝花組,有5種攀枝花組含量高于會東組。其中差異最大的組成成分為肌醇半乳糖苷,會東組含量高于攀枝花組。會東組中的尿苷、肌醇、2-哌啶甲酸、異亮氨酸、十八烷酸、脯氨酸、亞油酸、花生四烯酸、亮氨酸也高于攀枝花組。

塊菌具有豐富的營養成分和巨大的經濟價值,塊菌多糖和有機酸在塊菌抗氧化、抑菌、抗腫瘤上發揮著重要作用[19]。隨著對塊菌研究的深入,塊菌的價值被不斷開發,通過對會東地區和攀枝花地區的塊菌成分分析,找到了兩地中華塊菌在含量上有顯著性差異的化合物,這有利于對中華塊菌更好地進行產地區分,更合理地開采和利用塊菌資源。