液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用測定 食品中硒形態

◎ 謝佩文

（廣東亨盛維嘉食品工業有限公司，廣東 潮州 515726）

硒作為動物與人類必需微量元素，是合成硒蛋白，包含硫氧蛋白還原酶、谷胱甘肽過氧化酶、碘甲狀腺素脫碘酶的關鍵組成部分，對于甲狀腺激素代謝、繁殖、免疫力與抗氧化具有良好生物學功能。人體如果缺少硒元素，會降低人體免疫力，增加患癌癥與死亡風險。根據營養學會推薦，成人攝硒量每天為50～250 μg，不能超過400 μg，攝入800 μg會出現人體中毒癥狀。硒元素多用于食品功能成分，特別是人們生活水平得到提高后，對硒產品的需求量也逐漸增加，但硒元素過量攝入會對人體造成危害，健康硒食品發展中，也需明確硒是把“雙刃劍”[1]。本文采取液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用方式，分析食品硒形態，推動硒產品實現規范發展。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 儀器與設備

液相色譜-原子熒光聯用儀AS-53（廣西路博環保科技有限公司）；純水機Direct-Pure（北京中程瑞源科技有限公司）；分析天平LE204E/02（上海贊維衡器有限公司）；超聲水浴（濟南歐萊博電子商務有限公司）；抽濾設備（青島精誠儀器儀表有限公司）；超聲波清洗器KH3200B（青島明博環保科技有限公司）。

1.1.2 材料與試劑

硒形態標準品：甲基硒代半胱氨酸（96%純度）；硒代胱氨酸（98%純度）；亞硒酸鈉（99%純度）；硒代蛋氨酸（99%純度），用超純水配制上述標準品為1 mg·L-1濃度溶液，放置于4 ℃下進行保存，配制溶液及處理樣品均使用超純水；硼氫化鈉、碘化鉀、氫氧化鈉、檸檬酸以及磷酸氫二胺，均為分析純（上海宏瑞化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

（1）碘化鉀堿溶液。氫氧化鈉稱取2.90 g倒入燒杯，以少量水溶解添加1 g碘化鉀，加水超聲溶解，稀釋定容至1000 mL。

（2）硼氫化鈉還原劑。鹽酸稱取100 mL，以水稀釋定容至1000 mL。

（3）超純水溶液。稱取超純水1 L后，超聲脫氣待用，根據實際以磷酸、氨水進行調節pH=8.0。

1.2.2 儀器色譜條件

（1）色譜條件。使用Hamilton 10 μm陰離子色譜柱，利用磷酸氫二胺、硼氫化鈉流動相分離硒形態。

（2）儀器條件。80 mA燈電流；270 V負高壓；500 L·min-1載氣流量；7 mm原子化器高度；1000 L·min-1屏蔽氣流量；2根15 W紫外燈；60 r·min-1泵速A； 70 r·min-1泵速B；300 ℃原子化器溫度。

1.2.3 樣品預處理

稱取1.00 g樣品放置在25 mL錐形瓶內，添加鏈霉蛋白酶E 10 mg溶于水，放入離心管內均勻混合，設置溫度37 ℃完成超聲提取，以60 r·min-1離心 30 min，取上清液通過有機膜過濾[2]。

1.2.4 方法條件

進樣量滿杯100 μL，開啟紫外小結，流動相A為超純水；流動相B為磷酸氫二胺溶液170 mol·L-1、 160 mol·L-1、150 mol·L-1，利用磷酸調節pH=6.3；流動相C為檸檬酸。衍生劑為300 mL·h-1碘化鉀堿溶液；500 mL·h-1鹽酸載流溶液；300 mL·h-1空氣；300 mL·h-1硼氫化鈉還原劑[3]。

2 結果與分析

2.1 優化儀器條件

2.1.1 選擇流動相

流動相選擇對分離目標化合物十分重要，硒形態分析流動相常見有醋酸鹽、檸檬酸、Tris緩沖液及磷酸鹽等，添加甲醇有花粉粒效果，綜合分析硒化合物性質，采取陰離子色譜交換柱，探究檸檬酸與磷酸氫二胺為流動相的分離硒形態，發現以檸檬酸為流動相，降低了硒代蛋氨酸靈敏度，重復性差，甚至實驗不會出峰，使用磷酸氫二胺溶液可避免上述缺陷，采取磷酸氫二胺成為流動相，硒形態分離中20 min即可達到基線。

2.1.2 選擇流動相濃度

流動相濃度分析中，分析磷酸氫二胺170 mmol·L-1、160 mmol·L-1、150 mmol·L-1，pH=6.3的溶液分離硒形態效果，發現溶液濃度是150 mmol·L-1時，靈敏度較低，出峰時間是27 min，時間較長；濃度是170 mmol·L-1時，顯示亞硒酸跟與甲基硒代胱氨酸峰值無法達到分離基線；濃度160 mmol·L-1時，分離硒形態效果更好，以此作為流動相濃度。

2.1.3 流動相pH值

考察流動相不同pH值對硒形態分離影響。流動相pH≤6.0時，未能檢測亞硒酸鈉響應值，逐步增加流動相pH值，pH=6.3可實現硒形態分離，縮短時間至24 min；將流動相pH值繼續提高至pH=6.8時，分離硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸程度降低。所以，選擇最佳流動相pH=6.3，且流動相pH=6.3時，4種硒形態均可分離，且甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、亞硒酸鈉以及硒代蛋氨酸的保留時間分別是 15.771 min、14.434 min、10.317 min以及5.381 min。

2.2 線性關系及檢出限

稱取硒代半胱氨酸0.0202 g，硒代胱氨酸0.0242 g、 亞硒酸鈉0.0234 g以及硒代蛋氨酸0.0226 g定容為100 mL，配制10～200 μg·L-1系列標準溶液，根據 1.2方法操作測定，以硒化合物濃度為縱坐標，橫坐標為對應峰面積繪制標準曲線，獲得方法線性關系及檢出限，結果如表1所示。

表1 4種硒形態線性關系與檢出限化合物表

結果表明方法在硒化合物濃度為10～200 μg·L-1時線性關系良好，相關系數均大于0.99，檢出限處于2.16～3.78 μg?L-1。4種 硒 化 合 物 色 譜 圖 如 圖1 所示。

圖1 硒形態色譜圖

2.3 精密度

精密度測試中，以配制的標準濃度試劑進行平行試驗，可獲得精密度。由試驗結果可知，甲基硒代半胱氨酸的精密度是3.6%，硒代胱氨酸精密度是2.8%，亞硒酸鈉精密度是3.2%，硒代蛋氨酸精密度是4.3%，均低于5%，滿足試驗需求。

2.4 加標回收率

選擇富硒大米不同硒含量作為試驗樣品，測定總硒含量是1.25 mg·kg-1，測試樣品不同形態下硒本底值，完成加標回收試驗，對3個濃度加標回收，不同濃度進行6個平行試驗，結果表明硒形態加標回收率為86.3%～104.4%，相對標準偏差低于5.0%， 見表2。

表2 加標回收率表（n=6）

2.5 樣品測定

本實驗中采取液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用方式測定富硒大米的有機硒形態，根據結果可知，富硒大米內僅檢出有硒代蛋氨酸。

3 結論

硒作為典型雙功能元素，是人體必需微量元素的同時，也存在毒性。硒具有抗氧化、抗癌、增強人體免疫力等作用，可對維生素利用與吸收進行調節，且參與調節合成蛋白質。人體如果長期缺硒會引發大骨節病、心腦血管疾病、糖尿病與克山病等[4]。而攝入硒過量超出安全閾值，也會損害人體，引發慢性或急性硒中毒，因此合理、科學攝入硒元素具有重要的作用。硒化合物形態多樣，且硒不同形態生物效應、功能、毒性存在差異，不能僅測定硒總含量，還需分析食品硒形態[5]。食品不同，性質也不同，硒蛋白形態與種類較為復雜，為迅速測定硒形態，本文結合硒的化學和物理性質，通過使用液相色譜-柱后衍生-原子熒光聯用的方式測定硒形態，對食品硒形態進行定量定性分析，精確度較高，可滿足測定要求。