納米材料在醫學檢測與疾病診斷中的應用

徐 穎，張 宇

(東南大學 生物科學與醫學工程學院，生物電子學國家重點實驗室，江蘇省生物材料與器件重點實驗室，江蘇 南京 210096)

隨著社會的發展與現代醫學的進步，人們對于健康的追求日益提高，醫學檢測在疾病的診斷和預防中發揮著越來越重要的作用。根據世界衛生組織《全球衛生估計》的最新數據顯示，2019年全球的死亡人數高達5 540萬，死亡原因大致可以分為以下3類：非傳染性疾病、傳染性疾病以及損傷，其中因非傳染性疾病死亡的人數占全部死亡人數的74%。然而，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自2019年12月暴發以來肆虐至今，傳染性疾病的死亡人數也在持續增長，其危害不容忽視。結合最近20年的數據，心血管疾病、癌癥、傳染性疾病、糖尿病、阿爾茨海默病等疾病仍是全球死亡的主要原因，對人類的健康造成嚴重威脅。疾病診斷，尤其是早期診斷，對于提高治療效果、降低治療成本以及死亡率具有重要的價值，已經得到醫學界的公認。

納米材料的發展為醫學檢測提供了新的強有力工具與發展方向，尤其是21世紀以來，納米技術成為各國研究的熱點方向之一，納米材料的研究以及納米器件的應用與開發逐步成熟。伴隨著醫療水平的進步，醫學檢測也朝著追求高靈敏度、高特異性、高準確性、快速高效、低成本的方向發展。傳統的檢測手段逐漸無法滿足更高標準臨床診斷的需求，而納米材料則憑借著其獨特優勢在醫學檢測領域得到廣泛應用。本文將介紹納米材料的基本特征以及檢測原理，綜述近幾年納米材料在傳染性疾病、腫瘤、代謝和內分泌疾病、神經系統退行性疾病、以及心血管疾病等方面檢測與診斷中的應用。

1 納米材料的基本特征以及檢測原理

納米材料指在三維空間中至少有一維處于納米尺度(0.1～100 nm)范圍或由它們作為基本單元而構成的材料，尺寸是納米材料定義中最為重要的元素[1]。正是因為粒徑在納米尺度的分布，納米粒子具有表面與界面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應、宏觀量子隧道效應等特性[2]，使其具有可區分于相同元素形成的大尺寸材料的特性，擁有光、聲、電、磁、熱以及其他優異的物理化學性質。

納米材料按照維度可以分為零維(納米顆粒、原子團簇等)、一維(納米線、納米棒、納米管等)、二維(納米膜、納米片等)和三維(納米塊體等)納米材料[3](圖1)。根據制備中使用的材料，納米材料主要可以分為以下幾類：1)碳基納米材料(如石墨烯、氧化石墨烯、碳納米管等)；2)無機納米材料，主要包括金屬(Au、Ag、Pt、Ni)、金屬氧化物納米顆粒(TiO2、MnO2、Fe3O4、Al2O3)、以及半導體(如硅和陶瓷)；3)有機高分子納米材料，指以有機材料為基礎的納米材料，如樹枝狀大分子、膠束、脂質體和聚合物納米粒等；4)納米復合材料，可以是金屬、無機非金屬或有機高分子納米材料的任意組合。

應用納米材料對疾病標志物(核酸、蛋白質、微生物、小分子物質等)的醫學檢測的原理主要是利用納米材料本身或者其表面修飾物對目標物的生物特異性結合，例如抗原-抗體結合、核酸的堿基互補配對、以及核酸適配體等，利用納米材料產生的檢測信號(例如電化學信號、熒光信號、比色信號、表面增強拉曼散射信號等等)實現對目標物的檢測，為生物醫學或其他應用創造新功能。根據疾病檢測的需要可以調整納米材料的性能[4]。另外，由于具有較大的比表面積，納米材料對目標物的接觸面積大為增加，可以提高檢測靈敏度。但是，納米材料所具有的高表面能也導致其很容易產生團聚和被體液(如血液、間質液體或黏膜分泌物)中的蛋白質包裹，這可能會改變其表面電荷和性質[5]，因此，通常需要對納米材料進行表面修飾。對納米材料表面進行化學改性可以增加其在水、血清和各種溶劑中的分散穩定性，增強其生物相容性和降低其對生物系統的毒性[6]。

2 納米材料在醫學檢驗中的應用

醫學檢驗對于疾病的早期檢測、確立適當的治療方法、以及預后分析等方面起著至關重要的作用。建立快速、準確、經濟的檢測方法是醫學檢驗要解決的關鍵問題。在這一背景下，納米材料憑借其靈敏度高、特異性強、快速高效等潛在優勢，在疾病檢測方面具有獨特的優勢。

2.1 納米材料用于傳染性疾病的診斷

傳染病或傳播性疾病是指那些可以通過細菌、病毒、真菌和寄生蟲傳播的疾病。20世紀以來，科技水平以及醫療衛生條件不斷提高，但各種傳染病依舊在世界范圍內流行傳播。常見的傳染性疾病包括流行性感冒(H1N1、H5N1、H7N9)、瘧疾、霍亂、冠狀病毒引發的肺炎(2003年的SARS以及2019年的COVID-19)、埃博拉病毒、肺結核、中東呼吸綜合征等等。傳染病是公共衛生和全球經濟的潛在風險，對全人類的生命健康造成嚴重威脅，開發新的、快速和可靠的方法來檢測這些傳染源對于預防這些疾病的流行至關重要[7]。這里主要介紹針對新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的檢測方法。

圖1 納米材料的分類[3]Fig 1 Classification of nanomaterials[3]

對于像COVID-19這種由病毒引發的傳染性疾病，病原學檢測在診斷中起著至關重要的作用。目前，對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的早期診斷主要采用基于熒光定量PCR或等溫核酸擴增的核酸檢測。然而，核酸測試需要提取RNA、反轉錄、基因擴增和數據分析等多個步驟，檢測用時較長，使得此類測試不適合現場和即時篩查[8]。另外，由于成本高昂，許多條件較差的社區或醫療保健系統無法實現這一目標。納米材料具有高比表面積，可以激發傳感器和分析物之間高效的表面相互作用，從而具備以更快的速度、更高的準確性來檢測病毒的能力。美國馬里蘭大學的研究人員基于金納米顆粒局部表面等離子體共振的性質和固有的光穩定性開發了一種選擇性的比色分析方法。該方法利用巰基修飾的反義寡核苷酸(ASOs)對金納米顆粒進行封端處理，從而靶向SARS-CoV-2病毒的N基因(核衣殼磷蛋白)，可以在10 min內從分離的RNA樣本中檢測出SARS-CoV-2核酸陽性病例[9](圖2)。另外，基于金納米顆粒，有研究團隊利用紙基電化學傳感器芯片[10]或者結合等離子體光熱(PPT)效應和局部表面等離子體共振(LSPR)傳感轉導的雙功能等離子體生物傳感器[11]，也成功地對核酸進行了快速檢測。

圖2 納米金顆粒靶向病毒N基因的反應示意圖[9]Fig 2 Scheme of targeting virus N gene with gold nanoparticles[9]

抗體檢測是一種輔助核酸診斷的方法。抗體檢測主要是針對SARS-CoV-2的棘突(S)蛋白、核衣殼(N)蛋白或者是SARS-CoV-2產生應答的免疫球蛋白(IgG、IgM或IgA)等相關蛋白，基于納米酶[12]、磁珠[13]、金納米顆粒[14-15]等納米材料進行COVID-19的篩查研究正在涌現。抗體檢測的篩查準確性較低，往往需要對多種抗體進行驗證。檢測抗體的血清學分析可以作為對逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)標準方法的一個重要補充，具有一定的研究價值。

2.2 納米材料用于惡性腫瘤的診斷

癌癥相關生物標志物是腫瘤發生發展過程中出現異常表達的相關物質，包括DNA、RNA、蛋白質、脂質、代謝物等，是特定癌癥狀態的量化指標[16]，主要分為3類：預測性生物標志物、預后生物標志物和診斷性生物標志物。它們的檢測對于識別不同臨床分期的患者以及制定適應性治療策略具有重要意義。在癌癥治療中，腫瘤侵襲性生物標記物的早期檢測有助于惡性腫瘤的早期診斷和早期治療，并為癌癥患者帶來更高的生存機會。

大多數生物標記物從腫瘤中脫落的比率較低，循環中的極大稀釋以及分泌的生物標記物缺乏特異性都會影響腫瘤的早期檢測。納米材料靈敏度高、特異性強等特點可有效改善這種情況。

基于蛋白質類標志物的檢測仍是癌癥早期篩查的主要策略，例如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA125)、前列腺特異性抗原(PSA)等等。這一類腫瘤標志物主要利用特定抗體修飾的納米材料進行檢測。例如，Song等[17]將聚苯胺嵌入到二硫化鉬與還原氧化石墨烯納米片夾層中，構建了還原氧化石墨烯/二硫化鉬@聚苯胺層狀納米片(rGO/MoS2@PANI)的三維陣列作為電化學免疫傳感器，通過rGO和MoS2之間良好的協同作用，使復合材料的導電性增加，能更有效地檢測血清中的癌胚抗原(CEA)；在另外一項研究中，通過在聚多巴胺修飾的多壁碳納米管表面接枝聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)，為電化學免疫傳感器捕獲抗體提供了結合位點，同時，還原氧化石墨烯/金納米顆粒修飾玻碳電極作為工作電極有助于放大檢測信號，從而實現癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)的同時高靈敏度檢測[18]。

miRNA是一類長度為 21～25個核苷酸的小分子單鏈 RNA，多存在于腫瘤細胞來源的外泌體中，能夠在患者血液循環中穩定存在，作為腫瘤標志物已得到廣泛應用，其中基于核苷酸序列堿基互補配對的生物傳感工具被大量研究[19]， 例如，Zhao等[20]報告了一種使用納米耀斑實現的熱泳傳感器，用于高靈敏度的外泌體miRNA原位檢測，其原理是DNA探針與靶miRNA雜交后產生熒光信號，攜帶納米耀斑的外顯子隨后通過局部激光加熱進行熱泳富集，使靶標miRNA所引起的熒光得到增強。基于金納米顆粒與二苯丙氨酸肽納米管的自組裝復合物(包含DNA探針)可用于前列腺癌潛在生物標記物miR-410的阻抗法檢測[21]。對于miRNA的檢測不涉及到價格昂貴的抗體，成本較低，檢測靈敏度高，響應速度快，因而有著較為廣闊的發展前景。

2.3 納米材料用于糖尿病的診斷

糖尿病是一種以血液中葡萄糖濃度升高為特征的嚴重疾病。世界衛生組織(WHO)指出，糖尿病影響全球數億人，特別是來自中低收入國家的人。如果治療不當，可能會導致嚴重的并發癥，如腎功能衰竭、失明、心臟病發作、卒中等。糖尿病預防和治療的關鍵在于持續監測和控制血液中葡萄糖的水平。

測量血糖水平最簡單也是最常用的方法是手指采血，但重復采血帶來的疼痛和伴隨的強烈壓力會使患者順應性降低，具有局限性。納米技術和傳感技術的進步使葡萄糖檢測向著小型化、智能化、低成本、用戶友好等方向發展。葡萄糖傳感器可以基于不同類型的傳感器，例如熱、光學、電化學、聲學和磁性等等。其中，研究最廣泛的是用酶作為傳感元件的電化學平臺, 圖3展示了可用于電化學葡萄糖傳感器的各種傳感材料[22]。

圖3 用于電化學葡萄糖傳感器的材料[22]Fig 3 Materials for electrochemical glucose sensors[22]

同時，葡萄糖的檢測不僅限于血液樣本，對患者唾液、汗液或者尿液中葡萄糖的檢測技術也不斷進步。Xuan等[23]將金和鉑合金納米顆粒電化學沉積到微加工的還原氧化石墨烯(rGO)表面，并將殼聚糖-葡萄糖氧化酶復合物集成到工作電極的修飾表面，開發了基于人體汗液的可穿戴式葡萄糖傳感器。對于尿液中的葡萄糖檢測，嵌入棉織物3D基質中的銀納米顆粒具有類似過氧化物酶活性[24]，將銀納米顆粒用化學鍍金屬沉積的方法結合在棉織物的單個纖維上，棉織物的高吸收性增加了銀納米顆粒的催化活性位點，可有效解決尿液中高糖濃度使天然酶活性迅速飽和的問題。在最近的一項研究中，研究人員用Cu2O納米立方體與石墨烯的復合物作為傳感器，檢測了真實唾液樣本中的葡萄糖含量[25]，檢測范圍為0.002～171 mmol/L，靈敏度高，適合唾液中葡萄糖的傳感范圍，準確率可以達到95%。綜上，多種葡萄糖傳感方法與生物傳感器的結合可以為糖尿病患者提供無痛、無壓、準確、實時的檢測平臺，對于糖尿病的預防和治療有重大意義。

2.4 納米材料用于神經退行性疾病的診斷

神經退行性疾病指由于神經元結構和功能的逐步喪失而導致神經系統的組成部分神經元死亡，這種衰退催生了中樞神經系統(CNS)無法治愈的病理異常[26]，包括慢性病(如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥、亨廷頓病等)和急性病(如創傷性腦損傷、腦缺血、癲癇等)。大腦對氧化應激極為敏感，許多中樞神經系統疾病的特點是活性氧(ROS)的積累，導致腦組織嚴重損傷和不可逆的神經退行性變[27]。神經系統疾病診斷具有挑戰性的根本原因在于許多慢性神經系統疾病的發展可能是緩慢的，疾病進展持續數年甚至更長時間，患者在開始時可能很少表現出明顯的癥狀。結合臨床研究，檢測神經退行性疾病的生物標志物主要有乙酰膽堿酯酶(AChE)、β-淀粉樣蛋白、tau蛋白、α-突觸核蛋白、泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、S100-β蛋白和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)以及相關的miRNA等[28]。

近年來，在神經退行性疾病的研究中，基于電化學的檢測方法發展迅速，Hassan等[29]綜述了帕金森病相關聯核蛋白的電化學生物傳感器的發展情況。熒光探針介導的生物標志物可視化技術由于具備快速、無創、靈敏、實時、高分辨率等特點[30]，在神經退行性疾病的早期診斷中越來越受到重視。另一項研究表明，基于靶蛋白與其對應抗體之間的免疫反應，使用基于吲哚的轉向熒光團進行熒光標記，可以測定不同類型生物體液(包括腦脊液、血清、唾液和尿液)中的微量阿爾茨海默病蛋白質生物標記物[31]。例如，Park等[32]開發了一種由不同熒光納米顆粒組成的新型試劑盒(WO2002/088706)，用于阿爾茨海默病早期診斷。研究人員使用該試劑盒對不同阿爾茨海默病相關生物標記物的表達水平進行量化，證實miR-106b和miR-153具有顯著的表達，兩者可以作為早期診斷標志物。類似的產品還有試劑盒WO2010/144634，是通過確認DNA甲基化程度作為表觀遺傳學標記來診斷阿爾茨海默病[33]。

2.5 納米材料用于心血管疾病的診斷

據世界衛生組織統計，心血管疾病是世界上最主要的死亡原因之一。血管中斑塊積聚而導致的動脈血流異常是心血管疾病的主要原因。心血管疾病可能導致某些患者突然死亡而無任何預兆，臨床上稱為急性心肌梗死(AMI)，早期的預防對于這種致命的疾病尤為重要。

急性心肌梗死的早期診斷需要檢測多種蛋白類心臟生物標志物，如肌紅蛋白(Myo)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)等[34]，其中，cTnⅠ的檢測是目前AMI早期診斷生物標志物的金標準。Yola等[35]提出了一種基于氮化硼量子點(BNQDs)的新型印跡生物傳感器方法，由于BNQDs的量子限制和邊緣效應，使得其分散性和熒光特性有較大的提升，利用分子印跡聚合物與BNQDs的協同作用，構建了分子印跡電化學生物傳感器，實現了血漿樣品中cTnⅠ的檢測。Wu等[36]報告了一種基于表面等離子體共振(SPR)的心臟生物標志物肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)三明治免疫分析方法，應用于人血清樣品中cTnⅠ的檢測，在復雜基質中表現出良好的選擇性。Zhang等[37]提出了一種基于銀核和金殼雙金屬納米粒子的表面增強拉曼散射(SERS)側向流分析(LFA)方法(圖4)，可以對心臟生物標志物Myo、cTnI和CK-MB進行多重定量檢測，用于急性心肌梗死(AMI)的早期診斷。

近年來，外泌體檢測在心血管領域受到愈加廣泛的關注，研究表明，外泌體參與多種心血管生理和病理過程，具有有益或有害的活性。外泌體中的miRNAs可以作為指示病理狀態的生物標志物。例如hsa-miR-208a在健康患者血漿中檢測不到，但在患者胸痛發作4 h后出現，且明顯早于肌鈣蛋白；來自同一家族的hsa-miR-208b也被評估為AMI的生物標志物，與肌鈣蛋白具有相似的產生趨勢[38]。值得注意的是，miRNA自身的固有特征，例如短序列、總RNA樣本中的低豐度、細胞中相對較低的表達水平以及家族成員之間的高序列相似性[39]，使miRNA的應用需要精細的分離、富集過程以及相關的信號放大策略，如雜交鏈式反應(HCR)、滾圈放大(RCA)、催化發夾組裝(CHA)等等。

3 總結與展望

納米技術的發展日新月異，在醫學檢測和疾病診斷中的應用也受到了更加廣泛的關注。納米材料的形態、結構、表面修飾等因素影響著納米材料的性能。用于醫學檢測的納米材料首先應該在靈敏度、特異性、準確性等方面具備優良的性質；其次，需要關注納米材料的安全性與生物相容性，以達到降低材料毒性反應和增強生物醫學功能的目的；另外，考慮到工業化的生產與應用，還應該考慮納米材料的成本以及檢測過程的難易程度與所用的時間。相關傳感技術與器件的高速發展也為納米材料的應用提供了新的機遇與挑戰，未來納米傳感器件逐漸向著小型、便攜、自動化、多功能等方向發展。納米材料各個方面的進步可為醫學檢測提供有力的支持，對疾病發生與發展做出更加快速準確的診斷，為維護全世界人類的生命健康做出貢獻。

圖4 基于核殼SERS納米銀的多重LFA的示意圖[36]Fig 4 Schematic illustration of the core-shell SERS nanotag-based multiplex LFA[36]