特異性壞死性凋亡抑制劑-1(Nec-1)減輕脊髓損傷模型大鼠膠質瘢痕的形成

陳 勝，王春明，嚴雪飛，毛淵青

(南京醫科大學附屬江蘇盛澤醫院/南京醫科大學康達學院盛澤臨床醫學院 骨科， 江蘇 蘇州 215228)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可導致機體運動功能和感覺功能喪失，甚至造成死亡，對患者造成極大危害[1]。膠質瘢痕是脊髓損傷后，由星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質前體細胞形成的一種邊界結構，在脊髓損傷后期阻礙神經元軸突的延伸和神經軸索的再生，抑制神經功能恢復。因此，抑制膠質瘢痕的形成，對脊髓損傷的恢復有重要意義。脊髓損傷后細胞會發生程序性死亡，細胞凋亡及自噬相關蛋白顯著增加[2]。Cathepsin B是一種半胱氨酸蛋白水解酶，調節細胞死亡和細胞內蛋白質分解代謝。Caspase家族蛋白是細胞凋亡的重要參與者，在局灶性腦梗死中發現cathepsin B可調控caspase-3蛋白酶，擴大細胞凋亡[3]。減少星形膠質細胞的活化，可以抑制瘢痕的形成。特異性壞死性凋亡抑制劑-1(necroptosis inhibitor-1/necrostatin-1,Nec-1)是小分子堿類物質,是程序性壞死的特異性抑制劑，在細胞的死亡和炎性反應中發揮重要作用。本文觀察Nec-1對脊髓損傷大鼠模型膠質瘢痕形成的影響，及其抑制瘢痕形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD雌性大鼠，體質量180～200 g{廣州醫科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(粵)2016-0158]}。進行常規飼養，適應飼養1周后用于研究。本研究遵循《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑：Nec-1抗體、caspase-3抗體、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體和波形蛋白(vimentin)抗體(Abcam公司)；cathepsin B抗體(Bioss公司)；辣根過氧化物酶標記(HRP)的山羊抗兔二抗(北京博爾西科技有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分為假手術組、模型組(采用改良Allen的重物墜落法[4])和Nec-1組(在大鼠側腦室注射10 μmol/L Nec-1溶液10 μL)，每組18只。

1.2.2 后肢運動評分及評價：用國際公認的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)進行評分，并用雙盲法評價大鼠后肢運動功能。

1.2.3 免疫熒光檢測膠質瘢痕的形成：取各組小鼠傷段的脊髓組織，制作冰凍切片，在37 ℃進行封閉1 h，加入GFAP一抗(1∶200)于4 ℃過夜，PBS清洗，加二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，PBS清洗3次后封片，用熒光顯微鏡進行觀察，用Image Pro Plus 6.0軟件進行軟件分析GFAP陽性率，GFAP陽性率=GFAP染色面積/組織總面積。

1.2.4 Western blot檢測傷段脊髓組織cathepsin B、caspase-3、GFAP和vimentin蛋白水平：快速取出組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于液氮中保存。提取組織總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，進行SDS-PAEE，轉膜、加一抗(1∶1 500)在4 ℃孵育過夜，次日，洗膜加二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后，加ECL發光液，在凝膠成像系統中拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 實驗組大鼠后肢運動功能BBB評分

與假手術組相比，模型組及Nec-1組BBB評分值均顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組BBB評分值顯著升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各組膠質瘢痕的形成

與假手術組相比，模型組7和14 d，Nec-1組GFAP陽性率顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組GFAP陽性率顯著降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 各組大鼠后肢運動功能BBB評分Table 1 BBB score of hind limb motor function of rats in each

圖1 免疫熒光檢測大鼠脊髓組織GFAP表達Fig 1 Expression of GFAP in rat spinal cord was detected by immunofluorescence

表2 各組大鼠脊髓組織GFAP陽性表達率Table 2 Positive expression rate of GFAP in spinal cord of rats in each

2.3 脊髓組織GFAP及vimentin蛋白的表達

術后第7及14天，與假手術組相比，模型組及Nec-1組GFAP和vimentin蛋白顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組GFAP和vimentin蛋白顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.4 脊髓組織cathepsin B和caspase-3的表達

術后第7天、14天，與假手術組相比，模型組、Nec-1組cathepsin B、caspase-3蛋白顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，Nec-1組cathepsin B、caspase-3蛋白顯著降低(P<0.05)(圖3)。

3 討論

脊髓損傷分為原發性損傷和繼發性損傷，前者對脊髓組織造成機械性損傷， 后者多伴隨著神經膠質細胞的凋亡和炎性反應等[5]。控制脊髓的繼發性損傷，可以減少神經元壞死，促進神經軸突再生。Nec-1是程序性壞死的特異性抑制劑，小鼠脊髓損傷后，Nec-1通過抑制受體相關蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)和RIP3的相互作用，減輕脊髓繼發性損傷[6]。Nec-1可有效減少小鼠腦組織缺損，促進活動功能和學習能力。本研究表明，術后模型組和Nec-1組BBB評分值降低，Nec-1組BBB評分值升高，提示Nec-1可促進脊髓損傷小鼠后肢運動功能的恢復。

A：GFAP protein expression；B：vimentin protein expression， a.sham， b.model， c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with model group

中樞神經系統損傷后，促進膠質瘢痕的形成。神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞特異性蛋白，中樞神經系統受損后，GFAP的表達量反映星形膠質細胞活化情況[7]。抑制星形膠質細胞增殖，可促進大鼠脊髓損傷恢復。中間絲波形蛋白(vimentin)是星形膠質細胞增生一種重要標志，脊髓損傷后，膠質瘢痕的形成與GFAP和vimentin的表達增加有關[8]。抑制GFAP和vimentin蛋白表達，抑制星形膠質細胞的活化，對脊髓損傷修復有重要作用[8]。本研究表明，術后第14天，模型組和Nec-1均可見NF-200熒光，與模型組相比，Nec-1組NF-200熒光標記強度降低，提示Nec-1干預可減少脊髓損傷大鼠瘢痕組織形成。進一步還觀察到，模型組及Nec-1組大鼠脊髓組織中GFAP和vimentin表達升高，Nec-1組GFAP和vimentin表達降低，提示Nec-1可能降低脊髓損傷大鼠脊髓組織GFAP和vimentin蛋白表達。

A.cathepsin B protein expression；B.caspase-3 protein expression；a.sham；b.model；c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with model group

細胞凋亡是脊髓的繼發性損傷的主要癥狀之一，caspase家族是細胞凋亡中的調控因子[9]。Cathepsin B在神經細胞中促進細胞色素c的釋放，促進caspase活化，引起細胞凋亡，Nec-1通過下調凋亡相關蛋白表達，有效緩解小鼠癲癇[10]。本研究表明，在脊髓損傷術后第7天和14天，模型組和Nec-1組cathepsin B及caspase-3蛋白表達均升高，與模型組相比，Nec-1組cathepsin B和caspase-3蛋白表達降低，與文獻報道[11]一致。提示Nec-1可抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織中cathepsin B和caspase-3表達。

調控cathepsin B和caspase-3的表達，抑制脊髓損傷大鼠膠質瘢痕形成，促進神經功能恢復。其具體作用機制尚需深入研究。