PATL2復合雜合變異致卵母細胞成熟障礙

霍明珠，張軼樂，徐家偉，史 昊，劉益棟，牛文彬

(鄭州大學第一附屬醫院 生殖醫學中心 河南省生殖與遺傳重點實驗室，河南 鄭州 450052)

人類卵母細胞的發育開始于胚胎，然后停止于減數分裂前期的雙線期和偶線期，這種停滯可長達幾十年，此時期的卵母細胞稱為生發泡(germinal vesicle, GV)[1],進入青春期后可在促黃體生成素峰的作用下恢復減數分裂。生發泡的破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)和第一極體的排出標志著卵母細胞核成熟[2]，卵母細胞發育到減數第二次分裂中期停滯，受精后可繼續完成減數第二次分裂。任何時期的改變都有可能導致卵母細胞成熟障礙以及胚胎發育異?；蛲?。卵母細胞成熟障礙主要的臨床表現是產生未成熟的卵子，并且體外不能培養成熟而導致原發性不孕[3]。卵母細胞成熟缺陷4型(OMIM：617743)是一種以卵母細胞成熟停滯為特征的不育癥，卵母細胞可在生發泡期顯示成熟停滯，也可在減數分裂中期Ⅰ(meiotic metaphase Ⅰ, MI)或者卵母細胞受精失敗和早期胚胎停滯[4]，其相關PATL2的突變是致病突變，但是目前關于PATL2遺傳突變圖譜尚不完全。本研究對1例原發不孕伴卵子成熟障礙患者進行全外顯子測序，對其父母進行Sanger測序驗證以及生物信息學分析探討遺傳學病因，為后續治療提供遺傳咨詢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象：患者，女，32歲。結婚9年，性生活正常，未避孕未孕9年，男方精液檢查正常。患者無家族史。患者分別于2017、2018、2019年在鄭州大學第一附屬醫院進行3次促排取卵，3次取卵情況總結(表1)。因卵子發育停滯在GV和MI時期，體外培養后仍不成熟，取消試管周期，顯微鏡下卵子形態(圖1)。本研究通過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準(批準號為KY-2021-0102)，患者及家屬簽署相關知情同意書。

1.1.2 試劑：QIAamp DNA 純化mini試劑盒(QIAGEN，51306)；MGIEasy外顯子組捕獲V5探針試劑套盒(深圳華大基因股份有限公司，1000007746)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取：采集患者及父母外周血樣，采用QIAamp DNA 純化mini試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 患者全外顯子組的測序(whole exome sequencing, WES)：采用MGIEasy外顯子組捕獲V5探針試劑套盒制備測序文庫，首先將DNA 打斷并制備雜交文庫，然后通過外顯子芯片對目標基因外顯子及臨近剪切區的 DNA 進行捕獲和富集，對捕獲文庫進行擴增和純化，最后使用 MGISEQ-2000 平臺對文庫進行高通量測序。

1.2.3 Sanger測序：根據WES結果對患者及父母進行Sanger測序驗證，針對PATL2(NM_001145112)第14及13外顯子，采用Primer3軟件(Primer3webversio n4.1.0)設計引物。c.1 289_1 291delTCC的上游引物：5′-CAGTGTGCTGAGGAGGTCTG-3′, 下游引物： 5′-GACTGTCCCCCAACTTACCC-3′;c.1 374A>G的上游引物：5′-AGTGCCTCTTAAAGTGGGGTC-3′,下游引物： 5′-AGAAACCGAAACTCTAGGGCA-3′。

表1 患者取卵情況表Table 1 Oocyte extraction of the patient

A.oocyte in germinal vesicle stage; B.oocyte in the first meiosis stage圖1 光學顯微鏡下患者卵母細胞形態Fig 1 Morphology of patient’s oocytes under light microscope(×200)

1.2.4 變異位點生物信息學分析：應用SIFT、Polyphen及Mutation對變異位點進行蛋白功能預測，應用UniProt(https://www.uniprot.org/)獲取PATL2的氨基酸序列，運用UCSF Chimera1.14軟件在PATL2編碼的蛋白質結構圖上對c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異位點標記以及位點變異后所致蛋白結構的變化圖，并繪制PATL2c.1 289_1 291del TCC(p.Leu430del)位點在蛋白質中的位置。

2 結果

2.1 患者全外顯子組測序結果

患者PATL2第14外顯子存在c.1 374A>G(p.Ile458Met)的雜合變異，第13外顯子上存在c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的缺失變異。HGMD對這兩種變異位點暫無收錄。根據美國遺傳學與基因組學學會 (American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南，c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異被判斷為疑似致病變異(PM1+ PM2+ PP2+ PP4)，c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)變異(PM1+ PM2+ PM4+ PP4)同樣被評為疑似致病變異。SIFT、Polyphen及Mutation預測其對蛋白功能影響，結果提示為有害變異(表2)。

2.2 Sanger測序結果

Sanger測序發現患者父親存在與患者PATL2第14外顯子上相同的雜合變異(c.1 374A>G)，患者母親存在與患者PATL2第13外顯子上相同的缺失變異(c.1 289_1 291delTCC)(圖2)。

2.3 變異位點生物信息學分析

PATL2第14外顯子上c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異，使第458位異亮氨酸變異為甲硫氨酸，并導致蛋白質結構發生變化(圖3),PATL2第13外顯子上c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的缺失變異使第430位亮氨酸缺失(圖4)，突變位點均位于PAT1結構域，所有的PATL1蛋白都有此結構域，其主要影響mRNA結合。

3 討論

PATL2蛋白是一種mRNA結合蛋白，在未成熟卵母細胞中特異性表達，抑制細胞內轉錄后翻譯過程；隨著卵母細胞的成熟，PATL2的表達逐漸消失。在卵母細胞增殖過程中，卵母細胞中積累了大量增殖和成熟所需的穩定的mRNA。大多數合成的mRNA被立即翻譯來支持卵母細胞的增殖和發育，但有30%的mRNA被儲存起來，用于隨后的翻譯、恢復減數分裂，而PATL2被視為與其他mRNA結合蛋白如CPEB[cytoplasmic polyadenylation element(CPE)-binding protein]和Xp54作用相關，控制著mRNA的穩定性[5-6]。PATL2中的致病變異大多集中在PATL2蛋白的PAT1結構域(第252位至491位氨基酸)，主要負責mRNA結合[7]。陳[8]等人對具有PATL2變異的原發不孕家系研究發現在卵母細胞成熟停滯患者中，PATL2變異使其蛋白表達減少，表明基因的表達水平對卵母細胞成熟有重要作用。

表2 PATL2位點變異預測表Table 2 Prediction of PATL2 locus variation

A,C.the patient and her father carried the mutation site of c.1 374A>G (p.Ile458Met)；B,D.the patient and her mother carried the mutation site of c.1 289_1 291delTCC (p.Leu430del)

A.protein structure diagram without site mutation; B.protein structure diagram after mutation at this site c.1 374A>G(p.Ile458Met)

圖4 變異位點在蛋白的位置Fig 4 Position of the mutation site in the protein

本例患者所取的卵母細胞均處于GV期或MI期，且在體外培養后仍不成熟，全外顯子測序發現在第14和13外顯子存在c.1 374A>G(p.Ile458Met)及c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的復合雜合變異，該變異位于PAT1結構域，使蛋白質結構發生改變，致PATL2功能的缺失。Marie Christou等[9]對PATL2缺陷的小鼠卵母細胞進行測序實驗，發現與卵母細胞成熟相關基因表達顯著下調。

卵母細胞成熟缺陷4型為常染色體隱性遺傳，患者父母均具有生育力，至于PATL2變異可能只限于影響女性生育能力，因為存在具有PATL2截斷變異的男性是具有生育能力的[4]。母親的缺失變異雖然具有生育力，但母親能把這種變異傳遞給子代，這也是具有卵母細胞GV阻滯的原發性不育女性中PATL2變異比例高的因素之一[10]。在非洲爪蟾卵母細胞中PATL2的過表達抑制了mRNA的翻譯，導致卵母細胞成熟障礙，而在多個卵母細胞成熟障礙的患者中發現PATL2的表達降低，說明PATL2表達上調或者下調都不能促進卵母細胞的成熟[8, 11-12]。

對于卵母細胞成熟障礙的患者，研究發現[13]對于TRIP13雙等位錯義致病變異導致卵母細胞成熟障礙，通過將TRIP13 cRNA注射到卵母細胞中可以促進卵母細胞的成熟。對本例患者，能否采用cRNA注射到卵母細胞的方式來治療由于[13]變異導致的卵母細胞成熟障礙需要進一步實驗來驗證，目前主要考慮供卵治療。