PATL2復合雜合變異致卵母細胞成熟障礙

霍明珠，張軼樂，徐家偉，史 昊，劉益棟，牛文彬

(鄭州大學第一附屬醫院 生殖醫學中心 河南省生殖與遺傳重點實驗室，河南 鄭州 450052)

人類卵母細胞的發育開始于胚胎，然后停止于減數分裂前期的雙線期和偶線期，這種停滯可長達幾十年，此時期的卵母細胞稱為生發泡(germinal vesicle, GV)[1],進入青春期后可在促黃體生成素峰的作用下恢復減數分裂。生發泡的破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)和第一極體的排出標志著卵母細胞核成熟[2]，卵母細胞發育到減數第二次分裂中期停滯，受精后可繼續完成減數第二次分裂。任何時期的改變都有可能導致卵母細胞成熟障礙以及胚胎發育異常或停滯。卵母細胞成熟障礙主要的臨床表現是產生未成熟的卵子，并且體外不能培養成熟而導致原發性不孕[3]。卵母細胞成熟缺陷4型(OMIM：617743)是一種以卵母細胞成熟停滯為特征的不育癥，卵母細胞可在生發泡期顯示成熟停滯，也可在減數分裂中期Ⅰ(meiotic metaphase Ⅰ, MI)或者卵母細胞受精失敗和早期胚胎停滯[4]，其相關PATL2的突變是致病突變，但是目前關于PATL2遺傳突變圖譜尚不完全。本研究對1例原發不孕伴卵子成熟障礙患者進行全外顯子測序，對其父母進行Sanger測序驗證以及生物信息學分析探討遺傳學病因，為后續治療提供遺傳咨詢。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象：患者，女，32歲。結婚9年，性生活正常，未避孕未孕9年，男方精液檢查正常。患者無家族史。患者分別于2017、2018、2019年在鄭州大學第一附屬醫院進行3次促排取卵，3次取卵情況總結(表1)。因卵子發育停滯在GV和MI時期，體外培養后仍不成熟，取消試管周期，顯微鏡下卵子形態(圖1)。本研究通過鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準(批準號為KY-2021-0102)，患者及家屬簽署相關知情同意書。

1.1.2 試劑：QIAamp DNA 純化mini試劑盒(QIAGEN，51306)；MGIEasy外顯子組捕獲V5探針試劑套盒(深圳華大基因股份有限公司，1000007746)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取：采集患者及父母外周血樣，采用QIAamp DNA 純化mini試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 患者全外顯子組的測序(whole exome sequencing, WES)：采用MGIEasy外顯子組捕獲V5探針試劑套盒制備測序文庫，首先將DNA 打斷并制備雜交文庫，然后通過外顯子芯片對目標基因外顯子及臨近剪切區的 DNA 進行捕獲和富集，對捕獲文庫進行擴增和純化，最后使用 MGISEQ-2000 平臺對文庫進行高通量測序。

1.2.3 Sanger測序：根據WES結果對患者及父母進行Sanger測序驗證，針對PATL2(NM_001145112)第14及13外顯子，采用Primer3軟件(Primer3webversio n4.1.0)設計引物。c.1 289_1 291delTCC的上游引物：5′-CAGTGTGCTGAGGAGGTCTG-3′, 下游引物： 5′-GACTGTCCCCCAACTTACCC-3′;c.1 374A>G的上游引物：5′-AGTGCCTCTTAAAGTGGGGTC-3′,下游引物： 5′-AGAAACCGAAACTCTAGGGCA-3′。

表1 患者取卵情況表Table 1 Oocyte extraction of the patient

A.oocyte in germinal vesicle stage; B.oocyte in the first meiosis stage圖1 光學顯微鏡下患者卵母細胞形態Fig 1 Morphology of patient’s oocytes under light microscope(×200)

1.2.4 變異位點生物信息學分析：應用SIFT、Polyphen及Mutation對變異位點進行蛋白功能預測，應用UniProt(https://www.uniprot.org/)獲取PATL2的氨基酸序列，運用UCSF Chimera1.14軟件在PATL2編碼的蛋白質結構圖上對c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異位點標記以及位點變異后所致蛋白結構的變化圖，并繪制PATL2c.1 289_1 291del TCC(p.Leu430del)位點在蛋白質中的位置。

2 結果

2.1 患者全外顯子組測序結果

患者PATL2第14外顯子存在c.1 374A>G(p.Ile458Met)的雜合變異，第13外顯子上存在c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的缺失變異。HGMD對這兩種變異位點暫無收錄。根據美國遺傳學與基因組學學會 (American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南，c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異被判斷為疑似致病變異(PM1+ PM2+ PP2+ PP4)，c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)變異(PM1+ PM2+ PM4+ PP4)同樣被評為疑似致病變異。SIFT、Polyphen及Mutation預測其對蛋白功能影響，結果提示為有害變異(表2)。

2.2 Sanger測序結果

Sanger測序發現患者父親存在與患者PATL2第14外顯子上相同的雜合變異(c.1 374A>G)，患者母親存在與患者PATL2第13外顯子上相同的缺失變異(c.1 289_1 291delTCC)(圖2)。

2.3 變異位點生物信息學分析

PATL2第14外顯子上c.1 374A>G(p.Ile458Met)變異，使第458位異亮氨酸變異為甲硫氨酸，并導致蛋白質結構發生變化(圖3),PATL2第13外顯子上c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的缺失變異使第430位亮氨酸缺失(圖4)，突變位點均位于PAT1結構域，所有的PATL1蛋白都有此結構域，其主要影響mRNA結合。

3 討論

PATL2蛋白是一種mRNA結合蛋白，在未成熟卵母細胞中特異性表達，抑制細胞內轉錄后翻譯過程；隨著卵母細胞的成熟，PATL2的表達逐漸消失。在卵母細胞增殖過程中，卵母細胞中積累了大量增殖和成熟所需的穩定的mRNA。大多數合成的mRNA被立即翻譯來支持卵母細胞的增殖和發育，但有30%的mRNA被儲存起來，用于隨后的翻譯、恢復減數分裂，而PATL2被視為與其他mRNA結合蛋白如CPEB[cytoplasmic polyadenylation element(CPE)-binding protein]和Xp54作用相關，控制著mRNA的穩定性[5-6]。PATL2中的致病變異大多集中在PATL2蛋白的PAT1結構域(第252位至491位氨基酸)，主要負責mRNA結合[7]。陳[8]等人對具有PATL2變異的原發不孕家系研究發現在卵母細胞成熟停滯患者中，PATL2變異使其蛋白表達減少，表明基因的表達水平對卵母細胞成熟有重要作用。

表2 PATL2位點變異預測表Table 2 Prediction of PATL2 locus variation

A,C.the patient and her father carried the mutation site of c.1 374A>G (p.Ile458Met)；B,D.the patient and her mother carried the mutation site of c.1 289_1 291delTCC (p.Leu430del)

A.protein structure diagram without site mutation; B.protein structure diagram after mutation at this site c.1 374A>G(p.Ile458Met)

圖4 變異位點在蛋白的位置Fig 4 Position of the mutation site in the protein

本例患者所取的卵母細胞均處于GV期或MI期，且在體外培養后仍不成熟，全外顯子測序發現在第14和13外顯子存在c.1 374A>G(p.Ile458Met)及c.1 289_1 291delTCC(p.Leu430del)的復合雜合變異，該變異位于PAT1結構域，使蛋白質結構發生改變，致PATL2功能的缺失。Marie Christou等[9]對PATL2缺陷的小鼠卵母細胞進行測序實驗，發現與卵母細胞成熟相關基因表達顯著下調。

卵母細胞成熟缺陷4型為常染色體隱性遺傳，患者父母均具有生育力，至于PATL2變異可能只限于影響女性生育能力，因為存在具有PATL2截斷變異的男性是具有生育能力的[4]。母親的缺失變異雖然具有生育力，但母親能把這種變異傳遞給子代，這也是具有卵母細胞GV阻滯的原發性不育女性中PATL2變異比例高的因素之一[10]。在非洲爪蟾卵母細胞中PATL2的過表達抑制了mRNA的翻譯，導致卵母細胞成熟障礙，而在多個卵母細胞成熟障礙的患者中發現PATL2的表達降低，說明PATL2表達上調或者下調都不能促進卵母細胞的成熟[8, 11-12]。

對于卵母細胞成熟障礙的患者，研究發現[13]對于TRIP13雙等位錯義致病變異導致卵母細胞成熟障礙，通過將TRIP13 cRNA注射到卵母細胞中可以促進卵母細胞的成熟。對本例患者，能否采用cRNA注射到卵母細胞的方式來治療由于[13]變異導致的卵母細胞成熟障礙需要進一步實驗來驗證，目前主要考慮供卵治療。