蛇菰多糖降低實驗性肝損傷大鼠肝臟BDNF和TrkB的表達

謝 雅，陳 穎，夏德堯，唐鮮娥，王鳳杰，3，陳顯兵*

(1.湖北民族大學附屬民大醫院 病理科, 湖北 恩施 445000; 湖北民族大學 2.醫學部; 3.科技學院, 湖北 恩施 445000)

肝損傷是各種因素導致的肝細胞損傷，從而影響肝臟的正常功能。近年來肝損傷已成為嚴重威脅人類身體健康的疾病之一，目前針對中藥治療肝損傷的研究越來越受到重視。筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHook. f.BIH)，別名紅菌、葛菌，是蛇菰科(Balanophoraceae)蛇菰屬植物，是土家族“四大名藥”之一，含有多糖和黃酮類等成分，具有清除自由基、降血壓、抗腫瘤、止血和降血脂的作用，能提高人體免疫功能[1-3]，但蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)對實驗性肝損傷的研究鮮有報道。本研究采用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立藥物性肝損傷模型[4]，通過檢測腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tryrosine kinase receptor B,TrkB)和凋亡相關蛋白及肝功能的變化，探討對D-gal致大鼠肝損傷的保護作用機制，為蛇菰多糖(BPS)的藥理作用和臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：半乳糖(D-galactose，D-gal)(Sigma-Aldrich 公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismu-tase,SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；測腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor，TrkB)、B細胞淋巴瘤蛋白 2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)抗體(Abcam 公司)。蛇菰多糖(BPS)為本實驗室自制筒鞘蛇菰的多糖提取物。該筒鞘蛇菰全株于2018年夏季采自湖北省恩施市望城坡，經湖北民族大學藥用植物分類與鑒定實驗室鑒定為蛇菰科蛇菰屬植物。筒鞘蛇菰經搗碎、水浸、加熱提取、過濾、醇沉、烘干等步驟得蛇菰粗多糖；再經Sevage法脫蛋白、水溶、氯仿-正丁醇分離上清、透析、凍干等步驟得BPS(相對分子質量為1 ku；級別為RC膜S/P6)。苯酚-硫酸法測定BPS多糖含量為61.3%。

1.1.2 大鼠：SPF級雄性SD大鼠50只，體質量(220±20)g，湖北省動物實驗中心[許可證號SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與分組：將大鼠隨機分為對照組(control)；D-gal組(model，皮下注射D-半乳糖200 mg/kg，等劑量蒸餾水灌胃)；BPS低(D-gal+BPS-L)、中(D-gal+BPS-M)、高(D-gal+BPS-H)劑量組(50、100和200 mg/kg BPS灌胃干預)。實驗動物正常進食和飲水，分籠伺養，自然光照周期，維持室溫24 ℃，濕度56%左右，共6周。實驗動物操作均符合動物倫理委員會制定的實驗動物操作標準，接受湖北民族大學動物倫理委員會的監督與檢查。

1.2.2 肝功能檢測：大鼠禁食12 h，腹腔注射10%的水合氯醛，取心臟血液，靜置2 h后離心取上清，采用全自動生化分析儀進行肝功能檢測。

1.2.3 檢測SOD活性和MDA含量：取肝組織約5 g，勻漿，離心后取上清液。取血清。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 肝臟HE染色：選取大鼠同一部位的肝組織，常規脫水、透明、石蠟包埋、切片(片厚4 μm)，蘇木素伊紅染色，鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化檢測BDNF、TrkB：取肝組織石蠟切片，脫蠟至水，抗原修復后，用雙氧水、血清封閉抗原，加入BDNF、TrkB一抗，濃度1∶500，4 ℃冰箱過夜，加入二抗，DAB顯色，鏡下觀察。

1.2.6 Western blot檢測BDNF、TrkB、Bcl-2、caspase-3和Bax蛋白：6周后，取肝臟組織加入裂解劑及蛋白磷酸酶抑制劑，冰上勻漿，離心，抽取上清，BCA法測定蛋白濃度。經SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，加Bcl-2、caspase-3、Bax、BDNF、TrkB一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次3 min，加二抗，室溫孵育2 h后TBST洗膜，ECL發光檢測，LAS4000mini凝膠成象系統顯影并分析，β-actin為內參。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

與對照組相比，D-gal組大鼠活動明顯減少，毛發粗糙不順，甚至有脫毛現象，進食減少。BPS干預后，上述狀態均有明顯改善，體質量也相對增加。

2.2 BPS對肝損傷大鼠谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的影響

與對照組相比，D-gal組ALT和AST水平升高(P<0.05)；與D-gal組相比，BPS各劑量組ALT、AST水平回降(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清中ALT和AST水平

2.3 BPS對肝損傷大鼠肝臟組織形態的影響

D-gal組大鼠的肝臟顏色變黃，體積增大，BPS不同劑量組的大鼠肝臟較D-gal組均有所改善。顯微鏡下，D-gal組肝細胞脂肪變性，少許淋巴細胞浸潤。BPS低、中、高劑量組的肝小葉結構完整，細胞排列整；中、高劑量組細胞水腫比低劑量組明顯減輕(圖1)。

2.4 BPS對大鼠肝組織中BDNF、TrkB定位表達的影響

D-gal組大鼠肝組織中BDNF、TrkB呈黃色或棕黃色顆粒，分布在胞漿內。與D-gal組相比，BPS各劑量組大鼠肝組織中BDNF和TrkB陽性表達強度降低，呈淡黃色細顆粒狀(圖2)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖1 各組大鼠肝組織HE染色結果Fig 1 Changes of liver tissues in each group by HE staining (×200)

2.5 BPS對大鼠血清中SOD和MDA水平的影響

與對照組相比，D-gal組SOD 活性降低(P<0.05)、MDA含量增加(P<0.05)；與D-gal相比，BPS各劑量組SOD 活性增加、MDA含量降低(P<0.05)(圖3)。

2.6 BPS對大鼠肝組織中Bcl-2、caspase-3和Bax表達的影響

與對照組相比，D-gal組大鼠肝組織中Bcl-2表達量顯著下降，Bax、caspase-3的表達量顯著上升(P<0.05)，與D-gal組相比，BPS低、中、高劑量組Bcl-2、Bax和caspase-3的表達明顯改善(P<0.05)(圖4)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖2 BDNF在各組大鼠肝組織中的表達Fig 2 Expression of BDNF in liver tissue of rats in each group(×200)

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖3 TrkB在各組大鼠肝組織中的表達Fig 3 Expression of TrkB in liver tissue of rats in each group(×200)

2.7 BPS對大鼠肝組織中 BDNF和TrkB的影響

Western blot結果顯示BDNF、TrkB在正常對照肝組織中表達較弱；D-gal組肝組織中BDNF、TrkB蛋白的表達明顯上調(P<0.05)；BPS低、中、高劑量組BDNF、TrkB的表達與D-gal組相比明顯降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

D-半乳糖作為磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑可引起肝損傷，被廣泛應用于肝損傷模型的制備[5]。D-gal通過抑制肝細胞內蛋白質和mRNA的合成導致肝細胞凋亡、壞死和炎性細胞浸潤[6]。ALT、AST是檢測肝功能的重要指標，ALT、 AST的升高情況可反應肝細胞的損傷程度[7]。本研究結果顯示，D-gal組大鼠體內ALT、AST表達水平明顯升高；蛇菰多糖干預后大鼠體內ALT、AST表達水平明顯降低，提示蛇多糖能明顯改善D-gal引起的肝損傷。

表1 大鼠血清中SOD和MDA的水平Table 1 SOD and MDA levels in rat

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

SOD是抑制自由基形成的主要抗氧化酶， MDA組大鼠體內ALT、AST表達水平明顯升高；蛇菰多糖干預后大鼠體內ALT、AST表達水平明顯降低，提示蛇菰多糖能明顯改善D-gal引起的肝損傷。MDA是脂質過氧化物的代謝產物，SOD活性降低，MDA水平升高會導致肝細胞損傷誘導肝細胞凋亡[8-9]。Caspase-3是細胞凋亡的主要執行者，Bcl-2為凋亡抑制蛋白。Bcl-2水平升高可抑制Bax的作用，阻斷細胞色素c釋放，從而抑制caspase-3的活性，抑制細胞凋亡[10]。本實究結果表明，D-gal組中SOD活性明顯降低，MDA的含量明顯增加，BPS干預后SOD活性增加，MDA的含量降低，同時Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白的表達發生了相應的改變。提示BPS具有提高機體抗氧化能力和抑制肝細胞凋亡的作用。

BDNF是重要的營養因子，可特異性結合其受體TrkB，使其磷酸化并激活細胞內的酪氨酸激酶信號通路[11]，發揮生物學效應。研究發現，BDNF和TrkB不僅存在于海馬等組織中，還存在于多種受損的組織中，肝組織中BDNF表達的增加可能導致肝病的高發病率[12]。本研究中，BDNF和TrkB在正常肝組織中無表達，D-gal損傷后表達明顯增加，BPS干預后表達降低，提示BPS對肝臟的保護作用與BDNF、TrkB的表達降低有一定聯系。

綜上所述，BPS可以提高D-gal誘導的肝損傷后細胞的肝臟的抗氧化能力，表現為肝細胞內SOD活性升高，MDA含量降低；同時可提高肝組織中Bcl-2的表達、從而抑制Bax和caspase-3的表達水平，達到抑制肝細胞凋亡的作用；BPS還可改善D-gal誘導的肝損傷后細胞中BDNF和TrkB的表達，從而發揮肝臟保護作用。BPS是筒鞘蛇菰(BIH)的提取物，其護肝作用機制尚不清楚，因此深入研究其作用機制對開發中藥治療肝損傷具有重要的理論意義和實用價值。