PF-127-LV-NTFs三維復合支架培養大鼠神經干細胞

梁國新，梁茵茹，劉淑賢，陳康振，林 勇，秦江霞*，吳洪福*

(1.廣東醫科大學附屬第三醫院(順德龍江醫院)， 廣東 佛山 528318； 2.廣東醫科大學附屬廣州花都醫院，廣東 廣州 510800； 3.廣東醫科大學 干細胞與再生組織工程重點實驗室， 廣東 東莞 523808)

神經干細胞(neural stem cells, NSCs)是細胞移植常用的種子細胞[1]，但直接移植NSCs至損傷局部難以維持其良好的增殖狀態，且不利于移植NSCs進行增殖分化[2]。Pluronic F-127(PF-127)是一種溫敏性水凝膠，可作為NSCs體外擴增和移植的支架材料[3]。富含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域的Nogo 受體相互作用蛋白1[leucine-rich repeat(LRR) and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein 1,LINGO-1]是中樞神經損傷后抑制軸突再生和神經元分化的重要負性調控因子[4]，通過基因敲除工具短發卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)抑制NSCs LINGO-1基因的表達。此外，NSCs的增殖和分化還受到多種神經營養因子的影響，它們促進其增殖、分化和存活[7-8]。基于此，本研究擬用PF-127水凝膠負載編碼LINGO-1 shRNA慢病毒(lenctiviral,LV))及神經營養因子混合物(neurotrophic factors,NTFs)(PF-127-LV-NTFs)以構建復合支架，體外三維培養SD大鼠乳鼠大腦皮質腦組織來源NSCs，并觀察該復合支架對NSCs存活、增殖及分化的影響，評估該復合支架三維培養是否有利于NSCs的增殖和定向分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級0～3 d齡SD大鼠乳鼠2只，用于NSCs的提取[南方醫科大學動物實驗中心，許可證號：SYXK(粵)2017-0123]。

1.1.2 試劑：PF-127、多聚甲醛、膠質纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM/F-12、N-2添加劑、B27、青霉素鏈霉素、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Trizol、GAPDH、化學發光液和山羊抗大鼠Alexa Fluor 488、山羊抗兔Alexa Fluor 568(Thermo Fisher Scientific公司)；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech公司)；巢蛋白(Nestin)、RIPA裂解液、β-Ⅲ微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin)(Millipore公司)；PrimeSriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；LINGO-1、磷酸二酯酶(CNPcase)(Abcam公司)；HRP羊抗鼠/兔(ABclonal公司)；0.3% Triton X-100(Biomol公司)；5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(Genview公司)；Hoechst33342 (Cell Signaling Technology公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；LIVE/DEAD細胞活性檢測試劑盒(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 PF-127水凝膠的制備：在超凈工作臺內，稱取PF-127粉末溶解于NSCs完全培養基(DMEM/F-12加入2% FBS、1% N-2添加劑，2% B27，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF及1% 青霉素鏈霉素混合液)中，配制成濃度為30%的PF-127溶液，4 ℃搖床輕搖(50 r/min)過夜，直至完全溶解后放置于4 ℃保存備用。

1.2.2 NSCs的分離及鑒定：從乳鼠大腦皮質腦組織提取NSCs，加入NSCs完全培養基進行培養，Nestin免疫熒光染色鑒定NSCs。

1.2.3 慢病毒載體(lentiviral vector,LV vector)的構建和感染：病毒載體由GeneChem公司構建， shRNA序列如下：5′-TAAGCA CAACATCGAAATTG AATTCAAGAGATTCAATTTCGATGTTGTGCTTTTTTT TC-3′；RNAi陰性對照序列設計為：5′-CCGGTTCTC CGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTC GGAG-3′。慢病毒載體攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記，病毒滴度為2×108TU/mL，TU:transducing units。用感染復數(multiplicity of infection,MOI)=5，10，20的LV分別感染NSCs 72 h后在熒光倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.4 RT-qPCR檢測LINGO-1的mRNA：LV感染NSCs 72 h后，按PrimeSriptTMRT Master Mix和 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書操作。LINGO-1正向引物序列：5′-CTTTCCCCTTCGACA TCAAGAC-3′,反向引物序列：3′-CAGCAGCACCAGG CAGAA-5′。β-actin正向引物序列：5′-GTGGGGC GCCCCAGGCACCA-3′,反向引物序列3′-CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC-5′。相對表達量以β-actin為內參進行比較。

1.2.5 Western blot檢測LINGO-1的蛋白：LV感染NSCs 72 h后，用RIPA裂解液提取細胞蛋白，配制10% SDS-PGAE凝膠，電泳2 h后轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h并用TBST洗3次，分別加一抗LINGO-1及GAPDH，4 ℃冰箱過夜。次日回收一抗，TBST洗3次后加HRP羊抗鼠/兔二抗室溫孵育1 h，接著用化學發光液檢測。

1.2.6 神經營養因子混合物的配制：在0～4 ℃條件下,將BDNF(50 mg/mL)、NT-3(50 mg/mL)、PDGF(10 mg/mL)、IGF-1(10 mg/mL)、EGF(10 mg/mL)、bFGF(10 mg/mL)和GDNF(10 mg/mL)按5∶5∶1∶1∶1∶1∶1質量比混入PF-127溶液[7]。

1.2.7 NSCs的分組及處理：1)對照組：將液態PF-127水凝膠平鋪于24孔培養板中(200 μL/孔)，放置37 ℃培養箱待水凝膠凝固后，將200 μL細胞濃度為1.5×108個/L的NSCs懸液加于成膠化的水凝膠平面上培養，具體步驟參照[7]；2)PF-127組：用4 ℃液態PF-127水凝膠重懸NSCs，使細胞濃度為1.5×108個/L，將液態PF-127和NSCs混合物加至24孔培養板(200 μL/孔)中，放入培養箱中2～3 min，待凝膠凝固后加入200 μL完全培養基；3)PF-127+LV組：在PF-127組的基礎上加入LV(2×108TU/mL)，后續操作同PF-127組；4)PF-127+LV+NTF組：在PF-127+LV組的基礎上按方法1.2.6質量比加入NTFcocktail,后續操作同PF-127組。

1.2.8 免疫細胞熒光染色：用無菌PBS輕洗各組復合支架NSCs 2次，預冷的多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，0.3% Triton X-100透化15 min，PBS沖洗3次，5% BSA室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，涉及的一抗有：Nestin(1∶200)、 LINGO-1(1∶200)、β-Ⅲ Tubulin(1∶200)、GFAP(1∶200)、CNPcase(1∶200)，吸棄一抗，PBS沖洗3次，室溫避光孵育二抗1 h，涉及的二抗有：山羊抗大鼠Alexa Fluor 488(1∶500)，山羊抗兔Alexa Fluor 568(1∶500)；hoechst33342(1∶5 000)，室溫復染10 min，吸棄二抗，PBS沖洗3次后于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.9 CCK-8法檢測細胞活力：根據CCK-8試劑盒說明書檢測PF-127對NSCs的細胞活力影響，1、4和7 d后取出1塊培養板，每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育2 h后酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.10 活/死細胞的檢測(LIVE/DEAD)：培養7 d后，根據LIVE/DEAD細胞活性檢測試劑盒說明書操作，于熒光顯微鏡下觀察，紅色為死細胞，綠色為活細胞。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PF-127能均勻混合NSCs且無細胞毒性

NSCs中Nestin與LINGO-1共表達(圖1A)。光鏡下發現PF-127能與NSCs均勻混合(圖1B)。與對照組相比，PF-127組測得的CCK-8細胞活力值無統計學意義(圖1C)。

2.2 LINGO-1 shRNA能有效敲減LINGO-1的表達

編碼LINGO-1 shRNA的慢病毒載體感染NSCs的最適MOI=5(圖2A～C)。MOI=5的慢病毒能有效敲減LINGO-1的表達(圖2D～G)。

2.3 PF-127-LV-NTFs三維復合支架促進NSCs的存活和增殖

PF-127+LV+NTF組的細胞存活比例相比對照組及PF-127+LV組明顯增高(P<0.01)(圖3A,B)。免疫熒光染色PF-127+LV+NTF組Nestin陽性細胞率明顯多于對照組(P<0.01)，略多于PF-127+LV組(P<0.05)(圖3C,D)。

A.immunofluorescence staining (scale bar=20 μm); B.images of PF-127 gel (left) and PF-127 mixed with NSCs (right) under light microscopy(scale bar=100 μm); C.cell viability of NSCs co-incubated with PF-127

2.4 PF-127-LV-NTFs三維復合支架提高NSCs定向分化為神經元的比例

與對照組相比，在PF-127+LV組及PF-127+LV+NTF組β-Ⅲ Tubulin陽性細胞比例增加(P<0.01)，GFAP陽性細胞比例下降(P<0.01)，PF-127+LV+NTF組中CNPcase陽性細胞比例增加的(P<0.05)。與PF-127+LV組相比，PF-127+LV+NTF組β-Ⅲ Tubulin陽性細胞比例增加(P<0.05)，GFAP陽性細胞比例下降(P<0.05)(圖4)。

3 討論

NSCs移植后分布離散且損傷局部抑制性病理微環境使其分化為神經元困難等問題直接影響其治療療效[8-9]。近年來，組織工程學方法為細胞移植治療帶來新的思路，即移植治療中通過生物材料作為支架負載種子細胞或基因藥物。PF-127水凝膠具有良好的生物相容性、極低的細胞毒性以及在不同溫度下可實現凝膠態-液態的轉換等優點，是被廣泛使用的細胞支架及藥物緩釋系統載體[10]。在本研究中使用PF-127水凝膠培養NSCs，表現出其良好的生物安全性，提示PF-127水凝膠有助于NSCs存活、增殖，因此選擇PF-127水凝膠作為載體。LINGO-1是一種在中樞神經系統中表達的富含亮氨酸重復序列及免疫球蛋白樣結構域的蛋白，因其在中樞神經損傷后抑制軸突、神經元再生而備受關注[11-12]，抑制LINGO-1的表達可以促進NSCs的神經元定向分化[4]。本研究使用shRNA可以有效抑制LINGO-1的表達，從而促進脊髓損傷后神經元再生。證據表明神經營養因子可以滋養神經元并促進神經元存活和再生，在損傷局部起到抗炎、促進細胞增殖和分化的作用[13]。該研究采用的神經營養因子復合物涵蓋堿性bFGF、NT-3及BDNF等多種神經生長及營養因子，在PF-127-LV復合支架的基礎上加入NTFs，結合LIVE/DEAD及免疫熒光染色結果發現PF-127+LV+NTF組的NSCs存活率更高，NSCs增殖增強。為了檢測各復合支架對NSCs分化成各種譜系細胞比例的影響，分別用神經元標志性抗體β-Ⅲ Tubulin、星形膠質細胞標志性抗體GFAP以及少突膠質細胞標記性抗體CNPase進行免疫熒光染色， 結果發現PF-127+LV+NTF組定向分化為神經元的比例更優于其他組，以上結果提示PF-127水凝膠聯合編碼LINGO-1 shRNA慢病毒促進NSCs增殖分化的功能及神經營養因子混合物的營養作用，可以促進NSCs存活， 增強營養支持，促進NSCs定向分化為神經元。

A.representative images of GFP positive NSCs (scale bar=100 μm); B.infection efficiency of LV; C.quantification of the number of total cells; D-G.representative images showed expression of LINGO-1 protein of NSCs and quantification of relative expression level, normalized to β-actin or GAPDH; *P<0.01 compared with control; NC.negative control; LV.LINGO-1 shRNA lentivirus

A.live/dead cell viability assay of NSCs(scale bar=50 μm); B.quantitative analysis of cell viability of cells; C.proliferation of NSCs(scale bar=50 μm); D.quantitative analysis of proliferation; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; #P<0.01 compared with PF-127+LV

A.fluorescence staining results of NSCs differentiation(scale bar=50 μm); B.quantitative analysis of staining; *P<0.05, **P<0.01 compared with control; #P<0.05 compared with PF-127+LV; GFAP.glial fibrillary acidic protein; CNPase.cyclin nuclectide 3′phosphohydrolase

綜上所述，本研究構建了PF-127-LV-NTFs三維復合支架，該復合支架是良好的干細胞移植載體，有效促進體外移植NSCs的存活、增殖和分化。負載NSCs的PF-127-LV-NTFs復合支架可為中樞神經損傷后神經再生修復提供新的研究思路。