CircRNA_23113抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移

王靈霞，嚴玉蘭，袁海濤，蔡燁偉，劉德慧，谷文露，曹碧月

(江蘇大學附屬人民醫院 1.呼吸內科；3.普外科， 江蘇 鎮江 212002； 2.上海市松江區中心醫院 呼吸內科，上海 201600)

在全球范圍內，肺癌(lung canccer)是危害人類健康常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均位居首位[1]。近年來，肺腺癌在肺癌中的發病率逐年增加，盡管分子靶向治療取得了較好的臨床效果，但因突變人群陽性率偏低，肺腺癌患者總體5年生存率仍徘徊在20%左右[2]。因此，尋找新的肺腺癌早期診斷生物標志物和治療靶點是迫切需要的。

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類不具有或僅部分有編碼功能的共價閉合新型RNA分子，可在哺乳動物體內穩定存在。既往研究證實，circRNA在多種腫瘤中異常表達并誘導癌的發生發展[3]。CircRNA_001569在結腸癌組織及細胞中表達上調，其表達水平與結腸癌患者TNM分期和淋巴結轉移相關[4]。本研究通過高通量測序技術篩選出顯著差異性表達的環狀RNA circRNA_23113，然后檢測其在肺腺癌組織、血清及肺腺癌細胞系中的表達水平，并構建circRNA_23113過表達載體，對肺腺癌細胞的增殖和遷移生物學功能進行體外水平研究和初步機制探索，以期明確肺腺癌新型分子靶標，為臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：選取2019年1月至2020年1月在江蘇大學附屬人民醫院接受手術切除的肺腺癌患者癌組織及癌旁組織標本60對，所有患者均未接受術前化療或放療，術中及術后病理均提示肺腺癌；另采集45例肺腺癌患者未治療前及 45例門診體檢健康者的外周血5 mL于抗凝管內，3 000 r/min離心后收集血清于1.5 mL無酶管，-80 ℃儲存備用。該研究經過江蘇大學附屬人民醫院倫理委員會批準(批準號：K-20180043-Y)，并獲得參與者簽署的知情同意書。

1.1.2 細胞及試劑：人肺腺癌細胞系(A549、H1299、H1975細胞)和人支氣管黏膜上皮細胞系(BEAS-2B)(中國科學院細胞庫)；胎牛血清、RPMI 1640培養基(Gibco公司)；Trizol及Trizol LS試劑(Ambion公司)；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；過表達質粒(上海吉凱基因科技有限公司)；Lipofectamine 2000 Reagents(Invitrogen公司)；CCK-8試劑盒、Transwell小室(Corning公司)；兔β-catenin(Abcam公司)；cyclin D1、c-myc、β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養和分組處理：所有細胞用含有10%胎牛血清、含青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。過表達質粒組(OE-circRNA_23113組)和陰性對照組(OE-NC組)使用Lipofectamine 2000 Reagents將質粒轉染到H1299和A549細胞中，每次轉染6 h后更換培養液。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA：按照說明書的實驗步驟，使用Trizol及Trizol LS試劑來提取總RNA，反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒加樣后，在Applied Biosystems 7500 實時PCR系統上進行PCR 測定。所有實驗重復3次，并采用2-ΔΔCt方法分析circRNA_23113相對表達水平。選擇GADPH作為內參。GADPH引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATG AT-3′(正向)和5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′(反向)。CircRNA_23113引物序列5′-TCATCTTCACC CAGGTGTC-3′(正向)和5′-TCCTGTGCCATCTCCA ATTC-3′(反向)。

1.2.3 CCK-8法測定細胞活力：通過CCK-8試劑盒評估不同組細胞活力。將相應處理后的H1299和A549細胞(5×103個細胞/孔)接種到96 孔板中繼續培養 0、24、48和72 h，然后，將10 μL CCK-8和100 μL完全培養基加入每個孔中，將細胞在37 ℃、5% CO2下再培養1～2 h。最后，使用分光光度計測量450 nm處的吸光度值以代表細胞活力。每組實驗設置5個復孔。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞集落形成：將轉染的細胞(1×103個細胞/孔)接種在6孔板中。在恒溫培養箱中培養10～14 d后，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，用0.1%結晶紫染色菌落30 min，蒸餾水清洗干凈晾干后使用Image J軟件進行克隆細胞團計數。克隆形成率(%) = (克隆團數/接種細胞總數)×100%。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：用細胞劃痕實驗評估肺腺癌細胞的遷移能力變化。待6孔板細胞鋪滿90%以上時，10 μL 移液槍頭與直尺垂直在細胞培養板內劃痕，每孔穿過5條線，劃痕后用PBS漂洗細胞3次，清除劃掉的貼壁細胞，加入無血清培養基，同時用OE-NC質粒或circRNA_23113過表達質粒轉染，觀察拍照后計為0 h，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，再次取樣觀察、倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞遷移：通過Transwell小室遷移實驗檢測肺腺癌細胞的遷移能力。將轉染24 h后的細胞消化后，用200 μL 無血清培養基重懸細胞(5×104個細胞/孔)接種在Transwell(不含基質膠)上層小室內，在下層小室中添加800 μL含有10% FBS的培養基。然后在37 ℃、5% CO2培養箱中溫育24 h 后取出，棄去小室中的培養液，醫用棉簽輕柔擦拭小室上層內側未遷移的細胞，用PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS漂洗干凈后倒扣在超凈臺內風吹晾干，最后在倒置熒光顯微鏡下拍照并使用Image J軟件計數。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達：使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白質。通過10%的SDS-PAGE分離目標蛋白質,350 mA 110 min轉移到PVDF膜上。3% BSA封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。兔β-catenin(1∶500)，cyclin D1、c-myc(1∶1 000)。然后，將膜與山羊抗兔二抗(1∶5 000)在37 ℃下孵育2 h。β-actin(1∶1 000)作為內參對照。使用Image J軟件分析目標條帶。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CircRNA_23113的篩選

篩選出在肺腺癌與癌旁組織中具有顯著差異性表達的環狀RNA circRNA_23113(圖1)。

圖1 高通量測序結果Fig 1 High-throughput sequencing results

2.2 CircRNA_23113在肺腺癌組織、血漿和細胞系中顯著下調

CircRNA_23113在60例肺腺癌組織中的表達量顯著低于癌旁組織(P<0.001)；肺腺癌患者血漿中circRNA_23113表達水平低于健康體檢者(P<0.001)，circRNA_23113在肺腺癌細胞系H1975、H1299、A549的表達水平均低于正常支氣管黏膜上皮細胞BEAS-2B(P<0.05)。體外實驗選擇表達水平最低的A549和較低的H1299肺腺癌細胞進行circRNA_23113過表達質粒轉染用于后續實驗(圖2)。

2.3 過表達質粒轉染肺腺癌細胞后circRNA_23113表達水平明顯升高

CircRNA_23113過表達質粒轉染H1299、A549肺腺癌細胞24h后,OE-circRNA_23113組circRNA_23113的表達水平較OE-NC組明顯升高(P<0.05)，表示轉染有效(圖3)。

A.expression of circRNA_23113 in lung adenocarcinoma tissue n=3)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with normal control group

*P<0.05 compared with negative control group圖3 H1299和A549細胞中上調circRNA_23113表達的轉染效率Fig 3 Up-regulated transfection efficiency of circRNA_23113 expression in H1299 and A549 cells n=3)

2.4 CircRNA_23113表達抑制肺腺癌細胞增殖

CircRNA_23113過表達質粒轉染肺腺癌細胞系H1299、A549后，其細胞活力較OE-NC組顯著受到抑制(圖4A)。CircRNA_23113過表達后抑制了H1299、A549的克隆形成(P<0.05或P<0.01)(圖4B)。

2.5 CircRNA_23113抑制肺腺癌細胞的遷移

肺腺癌細胞系H1299、A549中OE-circRNA_23113組的劃痕愈合率明顯低于OE-NC組(P<0.01或0.05) (圖5A)。肺腺癌細胞H1299、A549中OE-circRNA_23113組的細胞遷移數目明顯低于OE-NC組(P<0.05)(圖5B)。

2.6 過表達circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表達

過表達circRNA_23113后，OE-circRNA_23113組較OE-NC組顯著降低了A549和H1299細胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc的蛋白表達 (P<0.01或0.001)(圖6)。

A.after circRNA_23113 over-expression the cell viability of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; B.after circRNA_23113 over-expression the colone formation of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; *P<0.05,**P<0.01 compared with negative control group

3 討論

肺癌是中國癌相關死亡的主要原因。盡管治療方式取得了進步，肺癌患者的預后仍然很差[5]。肺癌的發病機制復雜，涉及多基因、多因素、多通路，特別是與增殖和遷移相關分子的異常激活。相比線性RNA,circRNA缺乏5′末端帽子和3′末端多聚A尾結構，不易被核糖核酸酶降解，此特殊結構使其比線性RNA更易穩定存在[6]。CircRNA與腫瘤的增殖、侵襲和凋亡密切相關，具有為個體化治療確定敏感的生物標志物以改善臨床結局的潛力[3]。如circ_0007385在非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調，可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且該基因敲除后可降低異種移植腫瘤的生長[7]。有研究[8]發現，在用肉桂醛處理非小細胞肺癌細胞后，細胞中hsa_circ_0043256表達上調，發揮顯著的抑癌作用抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。本研究結果表明circRNA_23113在肺腺癌組織、血清及細胞中低表達。通過構建過表達質粒，上調H1299、A549細胞中circRNA_23113表達水平后，利用CCK8法、克隆形成、細胞劃痕和Transwell小室遷移實驗觀察到circRNA_23113可作為抑癌基因顯著抑制肺腺癌細胞增殖和遷移。腫瘤的發展與腫瘤細胞的無限增殖、侵襲和轉移密切相關。β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白分子的異常表達，參與癌細胞分化、侵襲和轉移[9]。研究證實circ_001569通過激活Wnt1、TCF4和β-catenin的蛋白表達水平促進了A549和H1299細胞的增殖[10]。上調circ-ITCH抑制了cyclin D1和c-myc的蛋白表達，減弱了乳腺癌細胞的增殖和侵襲[11]。本研究須在H1299、A549細胞中轉染circRNA_23113過表達質粒后，通過蛋白質印跡法證實circRNA_23113過表達后抑制β-catenin、cyclin D1以及 c-myc蛋白表達。這與肺癌發生發展中β-catenin、cyclin D1以及c-myc低表達后，肺癌細胞的增殖和遷移受到抑制相一致[12]。

A.after circRNA_23113 over-expression, the scratch healing rate of H1299 and A549 cells was significantly reduced; B.after circRNA_23113 over-expression, the migration number of H1299 and A549 cells was significantly reduced；*P<0.05, **P<0.01 compared with negative control group

綜上所述，本研究證實circRNA_23113在肺腺癌組織、血清及細胞中低表達和腫瘤的惡性生物學行為密切相關，并且circRNA_23113抑制β-catenin、cyclin D1以及c-myc的表達可能參與細胞惡性生物學行為的調控。因此circRNA_23113有望成為肺腺癌預后判斷的一個新型生物標志物，進一步探究circRNA_23113調控肺腺癌細胞增殖和轉移的具體機制為肺腺癌的早期診斷和治療方案的確定具有顯著的指導意義。

*P<0.01,**P<0.001 compared with negative control group圖6 過表達circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表達水平Fig 6 Expression levels of β-catenin, cyclin D1 and c-myc after over-expression of circRNA_23113 n=3)