呋塞米對腦出血模型大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及繼發性腦損傷的影響

張 瑜，高建洲，韓 韶

(邯鄲市第一醫院 東院區 神經外科，河北 邯鄲 056000)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是因腦血管破裂而引起的一種腦血管疾病，造成的腦實質內出血可對神經系統功能造成嚴重損害，ICH發病急、進展快，致殘率、病亡率極高，且預后不佳，給患者身心健康造成極大威脅[1]。內質網應激在ICH后繼發腦損傷的病理過程中起到重要作用，可造成腦水腫和神經元凋亡，引發神經功能障礙，另外，內質網應激導致的神經炎性反應會進一步加重腦損傷，因而抑制內質網應激可提高神經元存活率，減輕腦損傷[2]。RNA 依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白的同源蛋白(CCAAT enhan-cer binding protein-homologous protein，CHOP)通路是調控內質網應激的主要信號通路，在缺血/再灌注損傷、炎性反應和神經系統疾病等病理機制中起著關鍵的調控作用，下調該通路蛋白表達可減弱內質網應激，抑制炎性反應，降低神經細胞凋亡率，減輕腦組織損傷[3-4]，因而抑制PERK/eIF2α/CHOP信號通路激活可作為ICH的潛在治療手段。呋塞米(furosemide,FUR)是臨床常用的一種高效利尿藥，可抑制腎小管對鈉鉀離子重吸收，促進水分排泄，起到強效利尿作用，還可阻止鈉離子進入腦組織，減少腦脊液生成，降低顱內壓，減輕腦水腫，對ICH療效顯著，廣泛用于臨床[5]，但其對ICH大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及繼發性腦損傷的影響，目前還未有明確闡述，本文通過構建ICH大鼠模型，對此進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物: SD大鼠，雄性，SPF級，體質量200～240 g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號SCXK(魯) 2019 0003，參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》飼養在本院動物房，溫度為22 ℃～25 ℃，濕度為45%～55%，噪音≤50 dB，大鼠自由進食及飲水，光照晝夜循環(12 h/12 h)，適應性喂養1周，用于后續實驗。

1.1.2 主要試劑: Ⅳ型膠原酶(上海一研生物科技有限公司)；呋塞米(furosemide，FUR)注射液(遂成藥業股份有限公司)；單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液(齊魯制藥有限公司)；Evans藍(上海鈺博生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；大鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)及白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、兔源PERK、CHOP及p-eIF2α一抗、羊抗兔二抗(Abcam公司)；兔源p-PERK及β-tubulin一抗、鼠源eIF2α一抗(Santa Cruz公司)；羊抗鼠二抗(Cell Signaling Technology公司)；RIPA裂解液(上海吉至生化科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理: 參照文獻[6]，將大鼠分為假手術組、模型組(腦定位注射Ⅳ型膠原酶,建立ICH模型)、FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂干預組，每組18只。分別配制為1、2、4 mg/mL的FUR[8]溶液和5 mg/mL單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉[9]溶液，藥物處理組大鼠均經尾靜脈注射給藥，劑量為1 mL/kg，假手術組與模型組大鼠均尾靜脈注射1 mL/kg的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，持續14 d。

1.2.2 大鼠神經功能缺損的檢測: 第14天給藥后24 h，根據各組大鼠行為活動情況檢測其神經功能，并參照Longa評分[7]法進行評分，從行為活動正常到死亡共分為5級，得分從0到5分。

1.2.3 大鼠血腦屏障損傷的檢測：神經功能缺損檢測結束后，進行Evans藍外滲實驗檢測大鼠血腦屏障損傷：各組大鼠均隨機選取6只，以5 mL/kg的劑量股靜脈注射2% Evans藍染料，1 h后以乙醚麻醉，切下鼠頭，解剖分離大腦，稱量濕質量，以60 ℃甲酰胺對其浸泡，24 h后運用分光光度計測量浸出液中Evans藍含量。

1.2.4 標本收集及大鼠海馬神經元損傷情況的檢測：各組大鼠再次隨機選取6只，自尾靜脈取血3 mL后麻醉處死，取出大腦，稱量濕質量，將其置于烤箱中烤干，稱量干質量，計算大腦含水量，公式：大腦含水量=(大腦濕質量-大腦干質量)/大腦濕質量×100%。將上述血液放入4 ℃，3 000 r/min離心15 min，吸取上清儲存在-80 ℃備用。各組最后剩余的6只大鼠，經麻醉后處死，解剖獲得大腦，取下相同部位腦組織約0.5 g儲存在液氮中備用；剩余腦組織經0.9%氯化鈉溶液漂洗后，置于特制小盒中，以OCT(optimal cutting temperature compound)包埋劑浸沒組織，放入液氮中速凍成塊，采用冰凍切片機做常規病理切片，置于室溫30 min后，以4 ℃丙酮固定10 min，參照試劑盒說明書的操作步驟進行HE染色，經75%、90%、100%乙醇依次脫水、二甲苯透明后，轉移至載玻片上封片，以顯微鏡采集任意5個視野圖像。

1.2.5 ELISA檢測大鼠血清IFN-γ、IL-6水平：參照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，檢測血清其中各炎性因子IFN-γ、IL-6水平。

1.2.6 免疫印跡法檢測大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白表達：取出1.2.4中各組大鼠腦組織，加入1.5 mL RIPA裂解液，勻漿后4 ℃，3 000 r/min離心20 min，以BCA法測量上清中總蛋白濃度，然后將各樣本濃度根據結果調至相同，加入上樣緩沖液，煮沸6 min變性，各取20 L樣品液上樣，電泳后濕轉，均于恒壓110 V下進行，將所得硝酸纖維素膜根據分子質量剪下目的蛋白條帶，以5%脫脂奶粉溶液于室溫下孵育2 h，封閉膜上蛋白非特異性位點，然后分別加入兔源PERK、CHOP、p-eIF2α、p-PERK、β-tubulin一抗和鼠源eIF2α一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗，加入對應的羊抗兔及羊抗鼠二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗，通過化學發光法對蛋白條帶顯影，然后放入凝膠成像儀中拍照，運用Image-J軟件得到蛋白條帶灰度值，并對各蛋白表達進行定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 呋塞米(FUR)對大鼠神經功能損傷的影響

模型組大鼠Longa評分相比假手術組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠Longa評分相比模型組均降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖1 大鼠Longa評分Fig 1 Neurological function Longa Score of rats

2.2 呋塞米(FUR)對大鼠腦水腫的影響

模型組大鼠大腦含水量相比假手術組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠大腦含水量相比模型組均降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖2 大鼠大腦含水量Fig 2 Water content of rat brain

2.3 呋塞米(FUR)對大鼠血腦屏障損傷的影響

模型組大鼠Evans藍滲出量相比假手術組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠Evans藍滲出量相比模型組均呈劑量依賴性降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖3 大鼠Evans藍滲出量Fig 3 Evans blue exudation in rats

2.4 呋塞米(FUR)對大鼠海馬神經元損傷的影響

假手術組大鼠海馬神經元無損傷；模型組大鼠海馬神經元變性壞死，皺縮變小，數目明顯減少，呈現嚴重病理損傷；相比模型組，FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠腦海馬神經元病理損傷均減輕，且FUR各組隨劑量升高，海馬神經元病理損傷減輕程度增強，相比經節苷脂組，FUR-H組大鼠海馬神經元病理損傷減輕程度差異無統計學意義(圖4)。

2.5 呋塞米(FUR)對大鼠血清IL-6及IFN-γ水平的影響

模型組大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比假手術組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠血清IL-6及IFN-γ水平相比模型組均降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 呋塞米(FUR)對大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白表達的影響

模型組大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達水平相比假手術組明顯升高(P<0.05)。FUR-L、FUR-M、FUR-H組及神經節苷脂組大鼠腦組織PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達水平相比模型組均降低(P<0.05)(圖6)。

3 討論

ICH易發于中老年群體，發病迅速，病情危重，易引發偏癱、神經功能缺損等后遺癥，如今仍是一個尚未解決的醫學難題[10]。內質網是一種膜性細胞器，腦實質出血后，形成的血腫可刺激神經細胞產生內質網應激反應，引發嚴重的神經炎性反應，造成神經功能缺損及腦水腫，最終引發繼發性腦損傷[11]。本文采用腦定位注射Ⅳ型膠原酶的方法建立ICH大鼠模型，結果表明Ⅳ型膠原酶可造成腦實質出血，誘發神經炎性反應，引起腦水腫，神經元凋亡，血腦屏障受損，最終導致神經功能障礙。

研究顯示，減輕腦水腫，對減輕ICH腦損傷具有重要意義，因而利尿脫水是ICH的有效治療方法，FUR作為一種強效利尿劑，可對腎小管髓袢升支粗段發揮作用， 在ICH的臨床治療中得到了廣泛應用[12]，但其藥理機制目前還未有詳細的闡釋。PERK/eIF2α/CHOP通路是主要的內質網應激通路，當內質網受到氧化應激、缺血/再灌注、鈣離子代謝紊亂及糖基化反應異常等病理因素刺激時，會發生應激反應， 此時PERK/eIF2α/CHOP信號通路激活，引發細胞凋亡和組織損傷，下調PERK及eIF2α磷酸化水平，可抑制CHOP蛋白表達，降低內質網應激，減少細胞凋亡，改善腦血管及腎組織損傷[13-14]，因而推測，FUR可能下調PERK/eIF2α/CHOP通路，抑制ICH后內質網應激，進而緩解其繼發性腦損傷。本文結果顯示，ICH大鼠經FUR處理后，其海馬神經元病理損傷有不同程度減輕，另外大鼠Longa評分、Evans藍滲出量、大腦含水量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表達水平均降低，且呈劑量依賴性，表明FUR可下調PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白表達，抑制內質網應激及炎性反應，減少海馬神經元凋亡，緩解腦水腫，改善ICH大鼠神經功能障礙。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group圖4 HE染色檢測大鼠海馬神經元損傷情況Fig 4 HE staining was used to detect the damage of hippocampal neurons (scale bar=50 μm)

*P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group圖5 ELISA檢測大鼠血清IL-6及IFN-γ水平Fig 5 ELISA was used to detect the serum levels of IFN-γ and IL-6 in rats(pg/mL)

綜上所述，FUR可降低PERK、eIF2α磷酸化水平，下調CHOP蛋白表達，減弱內質網應激及炎性反應，緩解腦水腫和神經元損傷，減輕ICH引發的繼發性腦損傷，促使神經功能修復，抑制PERK/eIF2α/CHOP信號通路激活可能是其藥理機制之一，但本文只做了初步探究，還存在一定不足，后續還應使用該信號通路激活劑及抑制劑進行對照驗證。

A.sham operation group；B.model group；C.FUR-L group；D.FUR-M group；E.FUR-H group；F.ganglioside group; *P<0.05 compared with sham operation group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with FUR-L group; ▲P<0.05 compared with FUR-M group